Proteinlerin Yapıtaşları: Amino Asitler

Proteinler vücudumuzda hormon olarak, nörotransmitter olarak, hücre iskeletinde, hücre membranında, transkripsiyon faktörü olarak, katalizör olarak vb. hem yapısal hem de reaksiyonlara yardımcı birçok işte görev alır. Canlılık için bu kadar önemli olan proteinler amino asitlerin peptit bağıyla birbirine bağlanmasıyla oluşur.

Amino asitler temelde alfa karbonuna bağlı amino grubu, karboksil grubu, hidrojen ve amino asitlerde değişik gösteren -R grup yani değişken gruptan oluşmaktadır. Öncelikle bünyelerinde hem baz olan amino grubunu hem de asit olan karboksil grubunu içerdiklerinden amino asitler amfoterik yani hem asit hem de baz gibi davranan molekül olarak adlandırılır.

Buna ek olarak, hem amino hem de karboksil grubu pH'a bağlı olarak iyonlaşabildiği için amino asitlerin net yükleri bulundukları solüsyonun pH'ına göre değişmektedir. Yukarıda bir örneği olan titrasyon grafikleri aracılığıyla bilinen pH'ta amino asitlerin yükleri tespit edilebilir.

Yukarıda da belirtildiği gibi -R grup amino asitten amino asite değişmektedir. Ve amino asitler içerdikleri -R grubunun özelliklerine göre hidrofobik, polar nötr, asidik ve bazik olmak üzere 4 temel kategoriye ayrılır.

Hidrofobik amino asitler glisin, alanin, valin, lösin, izolösin, metiyonin, fenilalanin ve triptofandan oluşmaktadır. Hidrofobik oldukları için sitoplazmik proteinlerin genellikle iç kısımlarında membran proteinlerinin ise genellikle dış kısımlarında bulunmaktadırlar.

Glisin amino asidi amino asitlerin en basit olanıdır. -R grup olarak hidrojen içermektedir. Bu yüzden de alfa karbonu kiral karbon [ Kiral karbona bağlı olan 4 grup birbirinden farklı olmalıdır.] değildir. Bir başka deyişle glisin optik olarak aktif bir molekül değildir.

Metiyonin diğer amino asitlerden farklı olarak değişken grubunda kükürt atomu bulundurmaktadır.

Fenilalanin ve triptofan amino asitleri aromatik zincir içerdikleri için aromatik amino asitler grubunda bulunurlar. Ve yine bu aromatik zincirlerinden dolayı 280 nm'de ışık absorbe ederler. Bu özellik laboratuvarlarda test tübünün içerisindeki proteinin konsantrasyonunu ve saflığını ölçmek için kullanılmaktadır.

Polar-nötr amino asitler serin, treonin, tirozin, asparajin, glutamin ve sisteinden oluşmaktadır.

Serin, treonin ve tirozin amino asitleri -OH grubu içerdikleri için proteinler açısından oldukça önemlidir. Çünkü bu -OH grubu sayesinde proteinlere serin, treonin ve tirozin amino asitlerinden fosfor grubu eklenebilir. Bu olay fosforilasyon olarak adlandırılır ve proteinlerin fonksiyonunu düzenlemede oldukça önemli görevi olan bir post-translasyonel modifikasyondur.

Konuyla ilgili daha ayrıntılı olarak şunlar da söylenmelidir; Proteinleri fosforlayan enzimler kinaz olarak adlandırılır. Ve kinazlar temel olarak ikiye ayrılır; serin/treonin ve tirozin kinazlar. Tirozin kinazlar genellikle hücre bölünmesi ve büyümesi ile ilgili olan proteinleri düzenlemede görev alırlar. Bunun doğal bir sonucu olarak da mutasyonları genellikle kansere yol açmaktadır.

Ayrıca fenilalanin ve triptofan gibi tirozin de aromatik amino asitler grubundan yer almakta dolayısıyla 280 nm'de ışık absorbe etmektedir.

Polar amino asitlerden sistein amino asidi de proteinler için oldukça büyük bir önem arz etmektedir. Çünkü sistein amino asitleri -SH grubuna sahiptir ve iki sistein amino asidi bir araya geldiğinde oksidasyon olursa -S S- yapıda olan disülfit bağı oluşur. Disülfit bağı kovalent bağ olduğundan proteinlerin konformasyonunu stabil tutmada oldukça önemlidir.

Asidik amino asitler aspartik asit ve glutamik asitten oluşmaktadır. Bu amino asitler alfa karbona bağlı olan karboksil grubuna ek olarak -R gruplarında da karboksil grubu içermektedir. Bu sebepten de fizyolojik pH'ta yani pH=7.4'te negatif yüklü olarak bulunmaktadırlar.

Bazik amino asitler histidin, arjinin ve lizin amino asitlerinden oluşmaktadır.

Histidin -R grup olarak imidazol grubu içermektedir. İmidazol grubu amino grubu içerdiğinden histidin amino asidi fizyolojik pH'ta pozitif olarak yüklenmektedir. Ayrıca imidazol grubu Ni ve Zn metal atomlarıyla bağ yaptığından DNA rekombinant teknolojisinde his tagler daha sonradan IMAC ( Immobilized Metal Affinity Chromatography) yani immobilize metal affinite kromatografisi kullanarak purifiye etmek için kullanılmaktadır.

Arjinin ve lizin amino asitleri de histidin amino asidi gibi ekstra amino grubu içerdiğinden fizyolojik pH'ta pozitif yüklüdür. Bu yüzden de özellikle DNA ile etkileşime girecek olan proteinler [DNA negatif yüklü olduğundan ] yüksek oranda arjinin ve lizin içermektedir.

Uluslarası platformlarda ve protein sekanslarında yukarıda bahsedilen amino asitler ya 3 harfli kısaltmalarıyla ya da tek harfli kısaltmalarıyla ifade edilmektedir.

Yukarıda bahsedilen 20 farklı amino asit kodlandıkları mRNA'ya göre değişik sıralarda peptit bağı ile bir araya gelir ve proteinleri oluştururlar. Peptit bağının yapısı yukarıdaki resimdeki gibidir, yani bir amino asitin karboksil grubunun -OH grubunu diğer amino asitin amino grubunun ise -H'ını kaybetmesi sonucu yani bir suyun çıkması sonucunda oluşmaktadır. Ayrıca peptit bağı rezonans sonucu yarı çift bağ karakterine sahip olduğundan oldukça stabildir.

Poliakrilamid Jel Elektroforezi

Elektroforez elektrik alan kullanarak nükleik asit ve proteinleri porlu yapıya sahip bir jelde ayıran ve böylece onları analiz etmemizi sağlayan bir methoddur. http://aboutmolecularbiology.blogspot.com/2017/06/agaroz-jel-elektroforezi.html adlı yazıda anlatıldığı gibi nükleik asitleri analiz etmek için agardan yapılan bir jelin kullanıldığı agaroz jel elektroforezi kullanılır. Proteinleri analiz etmek için ise bu yazıda anlatılacak olan poliakrilamid jel elektroforezi kullanılır.

Öncelikle agaroz jel elektroforezinden en büyük fark olarak poliakrilamid jel elektroforezinde proteinler agaroz jel yerine akrilamid ve bisakrilamid adlı alt birimlerden oluşan poliakrilamid jelde  hareket ederler. Poliakrilamid jelin agaroz jelden farklılıklarından bir tanesi daha küçük porlar içermesidir. Böylece poliakrilamid jel aracılığıyla daha küçük maddeler ayrıştırılabilir.

Poliakrilamid jelin oluşturulması için öncelikle akrilamid ve bisakrilamid ( Burada akrilamid ve bisakrilamidin oranları oldukça önemli. Örneğin, eğer proteinler ayrıştırılacaksa 40:1 (akrilamid:bisakrilamid), nükleik asitler ayrıştırılacaksa 19:1 oranı kullanılmalıdır.) uygun bir tampon solüsyonla birlikte bir tübe konulur ve polimerizasyonlarını sağlamak amacıyla APS ve TEMED eklenir. Ayrıca belirtilmelidir ki akrilamid hem bir nörotoksin hem de kanserojen madde olduğundan jelin hazırlanışından analizine kadar her adımda gerekli güvenlik önlemleri alınmalıdır.

Agaroz jel elektroforezinin aksine poliakrilamid jel elektroforezinde jel dikey olarak dökülür ve iki temel katmana sahiptir: Yığma jeli ( stacking gel ) ve ayırma jeli ( separating gel ). Yığma jeli jelin üst kısmında bulunur ve pH'ı ayırma jeline göre daha düşüktür, pH= 6.8. Bu sayede yığma jelinde tampon solüsyondan gelen glisin amino asitleri nötr olarak bulunur. [ Konuyla ilgili daha detaylı bilgi edinmek isteyenler amino asitlerin iyonlaşabilen gruplarına bakabilirler. ] ve bu yüzden de + kutuba doğru olan hareketleri çok yavaştır. Onun tam tersine yine tampondan gelen ve negatif yüklü Cl iyonlarının + kutuba doğru olan hareketi çok hızlıdır. Böylece yığma jelinde jele yüklenen proteinler Cl iyonları ile glisin amino asitleri arasında sıkışır. Bu da tüm proteinlerin ayırma jeline aynı anda girmesini sağlar. Kısacası, yığma jelinin görevi herhangi bir ayrışma başlamadan tüm proteinleri aynı çizgide toplamaktır.  Yığma jelinin alt kısmında bulunan ayırma jelinin pH'ı ise 8.8'dir. Bu sayede ayırma jelinde glisin amino asitleri negatif yüklenir ve + kutuba doğru oldukça hızlı bir şekilde hareket ederler. Başka bir deyişle, proteinler artık glisin amino asitleri ve Cl iyonları arasında sıkışmış durumda değildir, hareket etmekte ve ayrışmakta özgürdür.

Agaroz jel elektroforezinde de olduğu gibi porlu bir yapıya sahip olan poliakrilamid jel elektroforezinde proteinlerin hareketleri onların yükleri, şekilleri ve büyüklüklerinden etkilenir. Bu kadar çok değişkenin bir araya gelmesi analiz açısından zor olacağı için proteinler jele yüklenmeden önce SDS ve beta-merkaptoethanol ile bir araya getirilir. SDS negatif yüke sahip bir deterjandır ve [yukarıdaki resimde de görülebileceği gibi] hem proteinin katlanmasında rol oynayan kovalent olmayan bağları bozarak proteinlerin şekillerini bozar, onları lineer bir hale getirir hem de tüm proteinleri negatif yükle yükleyerek hepsinin + kutuba doğru hareket etmesini sağlar. Beta-merkaptoethanol ise indirgeyici bir kimyasaldır. İndirgeyici özelliği sayesinde proteinlerin içerdiği disülfit bağlarını bozar yani SDS ile birlikte proteinlerin lineer bir şekil almasını sağlar. Kısacası, beta-merkaptoethanol ve SDS ile muamale edilen proteinler şekillerini kaybeder, negatif yükle yüklenir ve lineer bir hale gelir. Böylece porlu jelde ne kadar süratle hareket edeceklerini sadece büyüklükleri etkiler.

Buraya kadar özetlemek gerekirse, SDS ve beta-merkaptoethanol ile muamele edilen proteinler yığma ve ayırıcı olarak iki katmana sahip olan jele yüklenip elektrik alana maruz kaldığında proteinler büyüklüklerine bağlı olarak farklı hızlarda + kutuba doğru hareket ederler. Bir başka değişle, proteinler büyüklüklerine göre jelde ayrılır. Ve bu ayrışma şu şekilde olur; küçük olan proteinler daha hızlı hareket edebildiğinden jelin daha alt kısımlarında büyük olan proteinler ise daha yavaş hareket ettiğinden jelin daha üst kısımlarında konumlanır.

Bu aşamadan sonra yapılması gereken tek şey proteinleri jelde görünür kılmak ve büyüklüklerini belirlemektir. Proteinleri jelde görünür kılmak için uygulanan 2 temel method vardır; Gümüş nitrat boyama ve coomassie blue boyasıyla boyama. Günümüzde gümüş nitrat boyama hem pahalı olması hem de fazla uğraştırıcı olması sebebiyle laboratuvarlarda çok fazla kullanılmamaktır. Bu tekniğin tek avantajı çok hassas olması yani coomassie blue boyasıyla tespit edilemeyecek proteinleri jelde tespit edebilmesidir. [ Yukarıdaki resim: Gümüş nitrat boyama tekniğiyle boyanan bir jel ]

Coomassie blue boyası lizin ve arjinin başta olmak üzere amino asitlere bağlanır ve mavi renkte bir ışık yayar. Her protein belli bir oranda lizin ve arjinin  içerdiğinden dolayı jelin üzerine coomassie blue boyası döküldüğünde ve gerekli yıkamalar yapıldığında boya jelde sadece proteinlerin olduğu yerlerde konumlanır. Böylece de boyamanın ardından yukarıda da görüldüğü gibi protein içeren bantlar mavi renginde görülür. Ayrıca yayılan mavi ışığın şiddeti bandın içerdiği protein miktarına bağlı olduğundan coomassie blue boyasıyla proteinlerin konsantrasyonları tahmin edilebilir, dahası bradford assay methoduyla protein konsantrasyonu belirlenebilir.

Son olarak, tüm bu ayırma işlemlerinden sonra proteinlerin büyüklüğünü belirleyebilmek için jele yükleme yaparken büyüklüğü bilinen proteinler yani protein marker'ı da yüklenmelidir. Böylece yürütme işlemi bittikten sonra büyüklüğü bilinen proteinlerin bantlarıyla bilinmeyen proteinlerin bantları karşılaştırılarak proteinlerin büyüklüğü / ağırlığı belirlenebilir.

* Günümüzde laboratuvarlarda poliakrilamid jel elektroforezi genellikle daha sonra Western Blotting'de kullanmak üzere yapılır. Umarım başka bir yazıda Western Blot'u da anlatabilirim. Sevgiyle ve bilimle kalın :)

Genlerin Yapısı Ve Ekspresyonu | 1

• Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere tüm canlılarda ( prokaryotlarda ve ökaryotlarda) genetik bilginin akışı şu şekildedir : DNA - RNA- Protein. DNA kullanılarak RNA'nın sentezlenmesi olayına transkripsiyon denir ve bu olay nükleusta gerçekleşir. Transkripsiyon sonucu oluşan RNA tiplerinden ( Transkripsiyon sonucunda rRNA, tRNA, non-coding RNA, mRNA gibi RNA çeşitleri oluşabilir.)  biri olan mRNA'nın (mesajcı [messenger] RNA) kalıp olarak kullanılmasıyla protein sentezlenmesi olayına ise translasyon denir ve genellikle sitoplazmada ribozomlar tarafından gerçekleştirilir. ( Burada genellikle denilmesinin sebebi mitokondri ve kloroplast organellerinin kendi ribozomlarına sahip olması dolayısıyla bu organellerde de translasyonun gerçekleşmesidir.) 

• Fakat genetik akışın normalde DNA-RNA-Protein şeklinde olması onun her zaman öyle gerçekleşeceği anlamına gelmez. Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere bu konudaki istisnalardan biri retrovirüslerdir. Retrovirüsler genomlarına göre tek zincirli (+) RNA virüsü konuk hücre tiplerine göre ise hayvan virüsü olarak sınıflandırılırlar. Genom olarak tek zincirli RNA'ya sahip olan retrovirüsler hücreyi enfekte ettiklerinde kendilerini replike edebilmek için öncelikle genomlarını çift zincirli DNA'ya çevirirler. ( Yani burada RNA-DNA şeklinde bir genetik akış olur ve akış reverse transcription yani transkripsiyon olayının tersi olarak adlandırılır.) 

• Genomunu replike edebilmek için önce onu DNA'ya çevirmek zorunda olan retrovirüsler RNA'dan DNA sentezleyecek enzim yani reverse transkriptaz normal hayvan hücrelerinde bulunmadığı için onu yanlarında taşımak zorundadırlar. 
• Buna ek olarak, reverse transkriptaz genel olarak 3 farklı domaine sahiptir. Birinci domain retrovirüsün genomu olan tek zincirli RNA'yı baz alarak tek zincirli DNA sentezler. Bu aşamada önemli olan noktalardan bazıları şunlardır ki reverse transkriptaz da normal DNA polimerazlar gibi sadece 5'-3' yönünde sentez yapabilir ve sentezi başlatamadığı için primere ihtiyaç duyar. İkinci domain oluşturulan DNA-RNA hibridindeki RNA zincirini yıkar. Son domain ise oluşturulan tek zincirli DNA'yı baz alarak çift zincirli DNA sentezler.

• Çift zincirli DNA sentezlendikten sonra ise bu fragment enfekte edilen hücrenin genomuna entegre edilir ve provirüs olarak adlandırılır. Örneğin, HIV virüsü bir retrovirüstür ve bağışıklık sistemi hücrelerinden olan CD4 hücrelerini enfekte ettikten sonra ilk olarak yanında taşıdığı reverse transkriptazı kullanarak genomunu çift zincirli DNA'ya çevirir ve onu çekirdeğe göndererek hücre genomuna entegre eder. Bu işlemden sonra CD4 hücreleri her bölündüğünde dolayısıyla DNA'sını replike ettiğinde virüs genomu da onunla birlikte replike olur ve yeni oluşturulan hücrelere aktarılır. 

Sonuç olarak:

Transkripsiyon: Başlama

Transkripsiyon DNA'dan RNA sentezlenmesi olayıdır. DNA nükleusta bulunduğundan dolayı transkripsiyon olayı da nükleusta gerçekleşir.

Transkripsiyonda görev yapan ana enzim RNA polimerazdır. RNA polimeraz ribonükleotit trifosfattaki fosfat bağının enerjisini kullanarak ribonükleotitlerin arasındaki bağın yani fosfodiester bağının oluşmasını sağlar. RNA polimeraz sayesinde ribonükleotitlerin polimerleşmesi sağlanır başka bir deyişle RNA oluşturulmuş olur.

Prokaryotlar tek tip RNA polimeraza sahiptir. Ökaryotlar ise 3 tip RNA polimeraza sahiptir. Bu 3 RNA polimerazın görevleri şu şekildedir:

• RNA polimeraz I rRNA'ların sentezlenmesinden sorumludur.
• RNA polimeraz II mRNA ve snRNA'ların sentezlenmesinden sorumludur.
• RNA polimeraz III 5S rRNA ve tRNA'ların sentezlenmesinden sorumludur.

RNA polimeraz DNA'ya promotor denilen bir bölgeden bağlanır. Promotorun diğer DNA bölgelerinden farkı daha fazla adenin ve timin içermesidir. Başka bir deyişle promotor diğer DNA bölgelerine oranla daha az hidrojen bağı içermektedir. Böylece gen transkripte olacağı zaman DNA sarmalı kolayca açılabilmektedir.

Bakteri ve ökaryotlar promotorlarında farklı bölgelere sahiptir. Bakterilerin promotorunda pribnow kutusu ökaryotların promotorlarında ise TATA kutusu bulunmaktadır.

Transkripsiyonun başlangıç aşamasında, bakterilerin RNA polimerazı sigma alt birimi sayesinde promotoru tanır ve promotora bağlanır. Sigma alt birimi promotora bağlanış gerçekleştikten sonra RNA polimerazdan ayrılır.

Ökaryotlarda ise durum daha karmaşıktır. Ökaryotlarda RNA polimeraz promotora bağlanmadan önce TFIID,TFIIA,TFIIB ve TFIIH gibi transkripsiyon faktörleri promotoru tanır ve bağlanır. Bu faktörler RNA polimerazın promotoru tanımasına ve bağlanmasına yardımcı olur. RNA polimeraz promotora bağlandıktan sonra TFIIH ATP enerjisi kullanarak RNA polimerazı fosforlar ve onun senteze başlamasını tetikler.