Elektroforez elektrik alan kullanarak nükleik asit ve proteinleri porlu yapıya sahip bir jelde ayıran ve böylece onları analiz etmemizi sağlayan bir methoddur. http://aboutmolecularbiology.blogspot.com/2017/06/agaroz-jel-elektroforezi.html adlı yazıda anlatıldığı gibi nükleik asitleri analiz etmek için agardan yapılan bir jelin kullanıldığı agaroz jel elektroforezi kullanılır. Proteinleri analiz etmek için ise bu yazıda anlatılacak olan poliakrilamid jel elektroforezi kullanılır.
Öncelikle agaroz jel elektroforezinden en büyük fark olarak poliakrilamid jel elektroforezinde proteinler agaroz jel yerine akrilamid ve bisakrilamid adlı alt birimlerden oluşan poliakrilamid jelde hareket ederler. Poliakrilamid jelin agaroz jelden farklılıklarından bir tanesi daha küçük porlar içermesidir. Böylece poliakrilamid jel aracılığıyla daha küçük maddeler ayrıştırılabilir.
Poliakrilamid jelin oluşturulması için öncelikle akrilamid ve bisakrilamid ( Burada akrilamid ve bisakrilamidin oranları oldukça önemli. Örneğin, eğer proteinler ayrıştırılacaksa 40:1 (akrilamid:bisakrilamid), nükleik asitler ayrıştırılacaksa 19:1 oranı kullanılmalıdır.) uygun bir tampon solüsyonla birlikte bir tübe konulur ve polimerizasyonlarını sağlamak amacıyla APS ve TEMED eklenir. Ayrıca belirtilmelidir ki akrilamid hem bir nörotoksin hem de kanserojen madde olduğundan jelin hazırlanışından analizine kadar her adımda gerekli güvenlik önlemleri alınmalıdır.
Agaroz jel elektroforezinin aksine poliakrilamid jel elektroforezinde jel dikey olarak dökülür ve iki temel katmana sahiptir: Yığma jeli ( stacking gel ) ve ayırma jeli ( separating gel ). Yığma jeli jelin üst kısmında bulunur ve pH'ı ayırma jeline göre daha düşüktür, pH= 6.8. Bu sayede yığma jelinde tampon solüsyondan gelen glisin amino asitleri nötr olarak bulunur. [ Konuyla ilgili daha detaylı bilgi edinmek isteyenler amino asitlerin iyonlaşabilen gruplarına bakabilirler. ] ve bu yüzden de + kutuba doğru olan hareketleri çok yavaştır. Onun tam tersine yine tampondan gelen ve negatif yüklü Cl iyonlarının + kutuba doğru olan hareketi çok hızlıdır. Böylece yığma jelinde jele yüklenen proteinler Cl iyonları ile glisin amino asitleri arasında sıkışır. Bu da tüm proteinlerin ayırma jeline aynı anda girmesini sağlar. Kısacası, yığma jelinin görevi herhangi bir ayrışma başlamadan tüm proteinleri aynı çizgide toplamaktır. Yığma jelinin alt kısmında bulunan ayırma jelinin pH'ı ise 8.8'dir. Bu sayede ayırma jelinde glisin amino asitleri negatif yüklenir ve + kutuba doğru oldukça hızlı bir şekilde hareket ederler. Başka bir deyişle, proteinler artık glisin amino asitleri ve Cl iyonları arasında sıkışmış durumda değildir, hareket etmekte ve ayrışmakta özgürdür.
Agaroz jel elektroforezinde de olduğu gibi porlu bir yapıya sahip olan poliakrilamid jel elektroforezinde proteinlerin hareketleri onların yükleri, şekilleri ve büyüklüklerinden etkilenir. Bu kadar çok değişkenin bir araya gelmesi analiz açısından zor olacağı için proteinler jele yüklenmeden önce SDS ve beta-merkaptoethanol ile bir araya getirilir. SDS negatif yüke sahip bir deterjandır ve [yukarıdaki resimde de görülebileceği gibi] hem proteinin katlanmasında rol oynayan kovalent olmayan bağları bozarak proteinlerin şekillerini bozar, onları lineer bir hale getirir hem de tüm proteinleri negatif yükle yükleyerek hepsinin + kutuba doğru hareket etmesini sağlar. Beta-merkaptoethanol ise indirgeyici bir kimyasaldır. İndirgeyici özelliği sayesinde proteinlerin içerdiği disülfit bağlarını bozar yani SDS ile birlikte proteinlerin lineer bir şekil almasını sağlar. Kısacası, beta-merkaptoethanol ve SDS ile muamale edilen proteinler şekillerini kaybeder, negatif yükle yüklenir ve lineer bir hale gelir. Böylece porlu jelde ne kadar süratle hareket edeceklerini sadece büyüklükleri etkiler.
Buraya kadar özetlemek gerekirse, SDS ve beta-merkaptoethanol ile muamele edilen proteinler yığma ve ayırıcı olarak iki katmana sahip olan jele yüklenip elektrik alana maruz kaldığında proteinler büyüklüklerine bağlı olarak farklı hızlarda + kutuba doğru hareket ederler. Bir başka değişle, proteinler büyüklüklerine göre jelde ayrılır. Ve bu ayrışma şu şekilde olur; küçük olan proteinler daha hızlı hareket edebildiğinden jelin daha alt kısımlarında büyük olan proteinler ise daha yavaş hareket ettiğinden jelin daha üst kısımlarında konumlanır.
Bu aşamadan sonra yapılması gereken tek şey proteinleri jelde görünür kılmak ve büyüklüklerini belirlemektir. Proteinleri jelde görünür kılmak için uygulanan 2 temel method vardır; Gümüş nitrat boyama ve coomassie blue boyasıyla boyama. Günümüzde gümüş nitrat boyama hem pahalı olması hem de fazla uğraştırıcı olması sebebiyle laboratuvarlarda çok fazla kullanılmamaktır. Bu tekniğin tek avantajı çok hassas olması yani coomassie blue boyasıyla tespit edilemeyecek proteinleri jelde tespit edebilmesidir. [ Yukarıdaki resim: Gümüş nitrat boyama tekniğiyle boyanan bir jel ]
Coomassie blue boyası lizin ve arjinin başta olmak üzere amino asitlere bağlanır ve mavi renkte bir ışık yayar. Her protein belli bir oranda lizin ve arjinin içerdiğinden dolayı jelin üzerine coomassie blue boyası döküldüğünde ve gerekli yıkamalar yapıldığında boya jelde sadece proteinlerin olduğu yerlerde konumlanır. Böylece de boyamanın ardından yukarıda da görüldüğü gibi protein içeren bantlar mavi renginde görülür. Ayrıca yayılan mavi ışığın şiddeti bandın içerdiği protein miktarına bağlı olduğundan coomassie blue boyasıyla proteinlerin konsantrasyonları tahmin edilebilir, dahası bradford assay methoduyla protein konsantrasyonu belirlenebilir.
Son olarak, tüm bu ayırma işlemlerinden sonra proteinlerin büyüklüğünü belirleyebilmek için jele yükleme yaparken büyüklüğü bilinen proteinler yani protein marker'ı da yüklenmelidir. Böylece yürütme işlemi bittikten sonra büyüklüğü bilinen proteinlerin bantlarıyla bilinmeyen proteinlerin bantları karşılaştırılarak proteinlerin büyüklüğü / ağırlığı belirlenebilir.
* Günümüzde laboratuvarlarda poliakrilamid jel elektroforezi genellikle daha sonra Western Blotting'de kullanmak üzere yapılır. Umarım başka bir yazıda Western Blot'u da anlatabilirim. Sevgiyle ve bilimle kalın :)
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder