Moleküler Biyoloji ve Hücre Biyolojisi ile İlgili Hafıza Kartları | Memory Cards about Molecular Biology and Cellular Biology 2

Tekrar etmek hem benim uyguladığım ve çok faydalı bulduğum bir teknik hem de bilimsel olarak bir bilginin kalıcı olmasında çok etkili olduğu kanıtlanmış bir teknik. Bu yazı aracılığıyla paylaştığım hafıza kartlarından hem yeni bir şeyler öğrenebilir hem de ara ara bu hafıza kartlarına geri dönerek öğrendiğiniz şeyleri kalıcı hale getirebilirsiniz. Umuyorum ki sizler için de faydalı olur, sevgilerle.

Poliakrilamid Jel Elektroforezi

Elektroforez elektrik alan kullanarak nükleik asit ve proteinleri porlu yapıya sahip bir jelde ayıran ve böylece onları analiz etmemizi sağlayan bir methoddur. http://aboutmolecularbiology.blogspot.com/2017/06/agaroz-jel-elektroforezi.html adlı yazıda anlatıldığı gibi nükleik asitleri analiz etmek için agardan yapılan bir jelin kullanıldığı agaroz jel elektroforezi kullanılır. Proteinleri analiz etmek için ise bu yazıda anlatılacak olan poliakrilamid jel elektroforezi kullanılır.

Öncelikle agaroz jel elektroforezinden en büyük fark olarak poliakrilamid jel elektroforezinde proteinler agaroz jel yerine akrilamid ve bisakrilamid adlı alt birimlerden oluşan poliakrilamid jelde  hareket ederler. Poliakrilamid jelin agaroz jelden farklılıklarından bir tanesi daha küçük porlar içermesidir. Böylece poliakrilamid jel aracılığıyla daha küçük maddeler ayrıştırılabilir.

Poliakrilamid jelin oluşturulması için öncelikle akrilamid ve bisakrilamid ( Burada akrilamid ve bisakrilamidin oranları oldukça önemli. Örneğin, eğer proteinler ayrıştırılacaksa 40:1 (akrilamid:bisakrilamid), nükleik asitler ayrıştırılacaksa 19:1 oranı kullanılmalıdır.) uygun bir tampon solüsyonla birlikte bir tübe konulur ve polimerizasyonlarını sağlamak amacıyla APS ve TEMED eklenir. Ayrıca belirtilmelidir ki akrilamid hem bir nörotoksin hem de kanserojen madde olduğundan jelin hazırlanışından analizine kadar her adımda gerekli güvenlik önlemleri alınmalıdır.

Agaroz jel elektroforezinin aksine poliakrilamid jel elektroforezinde jel dikey olarak dökülür ve iki temel katmana sahiptir: Yığma jeli ( stacking gel ) ve ayırma jeli ( separating gel ). Yığma jeli jelin üst kısmında bulunur ve pH'ı ayırma jeline göre daha düşüktür, pH= 6.8. Bu sayede yığma jelinde tampon solüsyondan gelen glisin amino asitleri nötr olarak bulunur. [ Konuyla ilgili daha detaylı bilgi edinmek isteyenler amino asitlerin iyonlaşabilen gruplarına bakabilirler. ] ve bu yüzden de + kutuba doğru olan hareketleri çok yavaştır. Onun tam tersine yine tampondan gelen ve negatif yüklü Cl iyonlarının + kutuba doğru olan hareketi çok hızlıdır. Böylece yığma jelinde jele yüklenen proteinler Cl iyonları ile glisin amino asitleri arasında sıkışır. Bu da tüm proteinlerin ayırma jeline aynı anda girmesini sağlar. Kısacası, yığma jelinin görevi herhangi bir ayrışma başlamadan tüm proteinleri aynı çizgide toplamaktır.  Yığma jelinin alt kısmında bulunan ayırma jelinin pH'ı ise 8.8'dir. Bu sayede ayırma jelinde glisin amino asitleri negatif yüklenir ve + kutuba doğru oldukça hızlı bir şekilde hareket ederler. Başka bir deyişle, proteinler artık glisin amino asitleri ve Cl iyonları arasında sıkışmış durumda değildir, hareket etmekte ve ayrışmakta özgürdür.

Agaroz jel elektroforezinde de olduğu gibi porlu bir yapıya sahip olan poliakrilamid jel elektroforezinde proteinlerin hareketleri onların yükleri, şekilleri ve büyüklüklerinden etkilenir. Bu kadar çok değişkenin bir araya gelmesi analiz açısından zor olacağı için proteinler jele yüklenmeden önce SDS ve beta-merkaptoethanol ile bir araya getirilir. SDS negatif yüke sahip bir deterjandır ve [yukarıdaki resimde de görülebileceği gibi] hem proteinin katlanmasında rol oynayan kovalent olmayan bağları bozarak proteinlerin şekillerini bozar, onları lineer bir hale getirir hem de tüm proteinleri negatif yükle yükleyerek hepsinin + kutuba doğru hareket etmesini sağlar. Beta-merkaptoethanol ise indirgeyici bir kimyasaldır. İndirgeyici özelliği sayesinde proteinlerin içerdiği disülfit bağlarını bozar yani SDS ile birlikte proteinlerin lineer bir şekil almasını sağlar. Kısacası, beta-merkaptoethanol ve SDS ile muamale edilen proteinler şekillerini kaybeder, negatif yükle yüklenir ve lineer bir hale gelir. Böylece porlu jelde ne kadar süratle hareket edeceklerini sadece büyüklükleri etkiler.

Buraya kadar özetlemek gerekirse, SDS ve beta-merkaptoethanol ile muamele edilen proteinler yığma ve ayırıcı olarak iki katmana sahip olan jele yüklenip elektrik alana maruz kaldığında proteinler büyüklüklerine bağlı olarak farklı hızlarda + kutuba doğru hareket ederler. Bir başka değişle, proteinler büyüklüklerine göre jelde ayrılır. Ve bu ayrışma şu şekilde olur; küçük olan proteinler daha hızlı hareket edebildiğinden jelin daha alt kısımlarında büyük olan proteinler ise daha yavaş hareket ettiğinden jelin daha üst kısımlarında konumlanır.

Bu aşamadan sonra yapılması gereken tek şey proteinleri jelde görünür kılmak ve büyüklüklerini belirlemektir. Proteinleri jelde görünür kılmak için uygulanan 2 temel method vardır; Gümüş nitrat boyama ve coomassie blue boyasıyla boyama. Günümüzde gümüş nitrat boyama hem pahalı olması hem de fazla uğraştırıcı olması sebebiyle laboratuvarlarda çok fazla kullanılmamaktır. Bu tekniğin tek avantajı çok hassas olması yani coomassie blue boyasıyla tespit edilemeyecek proteinleri jelde tespit edebilmesidir. [ Yukarıdaki resim: Gümüş nitrat boyama tekniğiyle boyanan bir jel ]

Coomassie blue boyası lizin ve arjinin başta olmak üzere amino asitlere bağlanır ve mavi renkte bir ışık yayar. Her protein belli bir oranda lizin ve arjinin  içerdiğinden dolayı jelin üzerine coomassie blue boyası döküldüğünde ve gerekli yıkamalar yapıldığında boya jelde sadece proteinlerin olduğu yerlerde konumlanır. Böylece de boyamanın ardından yukarıda da görüldüğü gibi protein içeren bantlar mavi renginde görülür. Ayrıca yayılan mavi ışığın şiddeti bandın içerdiği protein miktarına bağlı olduğundan coomassie blue boyasıyla proteinlerin konsantrasyonları tahmin edilebilir, dahası bradford assay methoduyla protein konsantrasyonu belirlenebilir.

Son olarak, tüm bu ayırma işlemlerinden sonra proteinlerin büyüklüğünü belirleyebilmek için jele yükleme yaparken büyüklüğü bilinen proteinler yani protein marker'ı da yüklenmelidir. Böylece yürütme işlemi bittikten sonra büyüklüğü bilinen proteinlerin bantlarıyla bilinmeyen proteinlerin bantları karşılaştırılarak proteinlerin büyüklüğü / ağırlığı belirlenebilir.

* Günümüzde laboratuvarlarda poliakrilamid jel elektroforezi genellikle daha sonra Western Blotting'de kullanmak üzere yapılır. Umarım başka bir yazıda Western Blot'u da anlatabilirim. Sevgiyle ve bilimle kalın :)

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)| 1

• Polimeraz zincir reaksiyonu 1980'li yıllarda daha sonra bu buluşundan dolayı Nobel ödülü alan Kary Mullis tarafından icat edilmiştir. (Yukarıdaki resim Kary Mullis'in hayat hikayesini anlattığı kitabının kapağıdır ve bu noktada bence eklemek gerekir ki Kary Mullis hayat hikayesinin ilginçliğiyle diğer bilim insanlarından keskin bir şekilde ayrılmaktadır.) 

• PCR, DNA polimeraz enzimi sayesinde çok düşük konsantrasyonlu DNA örneklerinden bile yeni DNA zincirleri sentezleyen bir başka deyişle mevcut olan DNA fragmentini çoğaltan bir yöntemdir. Ve DNA polimeraz sadece 3'-OH ucuna yeni nükleotit ekleyebildiğinden ve bundan dolayı bir zincirin sentezini başlatabilmek için primere ihtiyaç duyduğundan PCR işlemi de primere ihtiyaç duyar.Bu sayede de (primerler sekansa spesifik olduğundan dolayı) PCR işlemiyle sadece istenilen DNA fragmentinin bilyonlarca kopyası saatler içinde elde edilebilir.

• PCR methodu kullanılarak sekanslama ve klonlama için gereken sayıda fragment elde edilebilir, bir genin yahut bir allelin genomda bulunup bulunmadığı kanıtlanabilir, babalık testi veya kriminal olaylarda şüphelilerin sayısı azaltılabilir ve laboratuvar ortamında üretilemeyen mikroorganizmalarla ilgili bilgilere ulaşılabilir.

• PCR reaksiyonu için gerekenler DNA örneği, primer, DNA polimeraz, dNTP, tampon solüsyon ve distile sudur. 

• Mevcut DNA örneğinden sadece istenilen bölgenin çoğaltılması olayında en önemli şeylerden biri ileri ve geri yönlü (forward and reverse primers) primerlerin doğru dizayn edilmiş olması ve doğru konsantrasyonda olmasıdır. Örneğin, primerlerin konsantrasyonu 0.1 - 0.5 µM ( genellikle tercihen 0.2 µM ) olmalıdır. Eğer primer konsantrasyonu gerekenden fazla olursa istenmeyen bölgelerin de amplifikasyonu gerçekleşebilir. Bununla birlikte eğer primer konsantrasyonu gerekenden az olursa istenilen fragmentten yeterli miktarda elde edilemeyebilir. Tabii ki bu noktada primerlerin özellikleri de ( Tm değeri, spesifiklik vs.) çok önemlidir. 

• PCR reaksiyonunda kullanılan primerler hücrede DNA replikasyonu sırasında kullanılan primerlerden farklıdır. DNA replikasyonu sırasında primeraz tarafından üretilen primerler tek zincirli RNA iken PCR sırasında kullanılan primerler tek zincirli DNAdır. 

• İleriki kısımlarda görüleceği üzere PCR çok yüksek ve dramatik olarak değişen sıcaklıklarda gerçekleşmektedir. Bu yüzden de eğer normal bir DNA polimeraz (örneğin insan hücrelerinde bulunan DNA polimeraz) kullanılırsa daha reaksiyon başlamadan enzim sıcaklıktan denatüre olacağı için amplifikasyon gerçekleşmez. Bu sebepten dolayı PCR reaksiyonu için genellikle Taq DNA polimeraz, (Thermus aquaticus' tan elde edilir) ve Pfu DNA polimeraz (Pyrococcus furiosus' tan elde edilir) kullanılır. Taq DNA polimeraz Pfu DNA polimeraza göre daha ucuz olması sebebiyle araştırmalarda daha çok kullanılmaktadır ancak Pfu DNA polimerazın hata oranı Taq DNA polimeraza oranla daha düşüktür. 

• DNA örneği de PCR reaksiyonu için gerekli olan şeylerden biridir. Bunun sebebi de DNA polimerazın yeni oluşturulan zincire nükleotit eklemek için şablona ihtiyaç duymasıdır. Buna ek olarak, GC oranı yüksek olan DNA örneklerinin (GC% > 60%) amplifikasyonu diğer DNA örneklerine göre daha zordur ve bu durumun en olası sebebi bu DNA örneklerinde oluşan kararlı ikincil yapılardır. Eğer araştırma esnasında böyle bir DNA örneğinin amplifikasyonu gerekiyorsa, bilim insanları genellikle  glycerol, DMSO (5-20%), formamide (5-20%) veya tetramethylammonium chloride (0.01-10 mM) gibi bileşikleri PCR solüsyonuna eklemektedir. 

• PCR solüsyonunu hazırlarken dikkat edilmesi gereken 2 önemli nokta vardır. Öncelikle istenmeyen kısımların amplifikasyonunu önlemek için PCR solüsyonu hazırlanırken DNA polimeraz en son ilave edilmelidir. İkinci olarak ise reaksiyonun başlamasını önlemek için tüm hazırlık aşamalarında solüsyon buz üzerinde tutulmalıdır. 

Hücre İskeleti | Giriş

• Yukarıdaki resimde görülen kırmızı, yeşil ve mavi renklerle işaretlenmiş olan filamentler hücre iskeletini oluşturur. Yani aslında hücre iskeleti sitoplazma boyunca dağılmış olan filamentler bütünüdür.

• Hücre iskeleti sayesinde hücreler belirli şekilleri alabilir hatta bazı özel hücreler hücre iskeletlerini tekrardan yapılandırarak değişen çevre koşullarına göre şekillerini değiştirebilirler. Ayrıca belirtmekte fayda var, hücre iskeleti hücreye şekil vermekle kalmaz, ona fiziksel dayanıklılık da verir.
• Amip ve bazı bağışıklık sistemi hücreleri hücre iskeletini oluşturan filamentlerden aktini kullanarak çevre koşullarına (özellikle bağışıklık sistemi hücreleri diğer hücrelerden salınan kimyasallara) göre hareket ederler.

• Hücre iskeleti hücreyi dış ortama adapte etmekle kalmaz bölünme, büyüme gibi özel durumlarda organelleri ve diğer hücre içi bileşenleri çeşitli yerlere taşıyarak hücre içi yapısını da değiştirir.

• Mitoz ve mayoz esnasında kromozomların ayrılması hücre iskeletini oluşturan filamentlerden mikrotübüller tarafından gerçekleştirilir. Ayrıca unutulmamalıdır ki mitoz ve mayoz sadece çekirdeğin bölünmesi olayıdır. 
• Karbonhidrat, yağ ve proteinlerin oluşan ve akışkan (dolayısıyla da kırılgan) bir yapıya sahip olan plazma membranına mekanik destek vermek hücre iskeletinin görevlerinden bir tanesidir.
• Hücre iskeleti kas ve nöron gibi oldukça özelleşmiş hücrelerin fonksiyonlarını yerine getirmesini sağlar. Örneğin, hücre iskeleti kas hücrelerin kasılmadan nöronlarda ise akson ve dendritlerin oluşumundan sorumludur.

• Sitoplazmada bulunan proteinler ve mRNA'lar her zaman homojenik bir şekilde dağılmaz. Yukarıdaki resimde görülen olay da bu düzensiz dağılımın örneklerinden biridir. Detaylıca anlatmak gerekirse, bazı durumlarda mRNA'ların veya proteinlerin sitoplazmanın bir kısmında yoğunlaşması çeşitli sonuçlara sebep olur. Örneğin, yukarıdaki resimdede görülebileceği üzere bölünmekte olan bir maya hücresinde yeni oluşacak hücrenin hücrenin hangi kısmından çıkacağı ash1 olarak adlandırılan mRNA'nın hücrenin hangi kısmında yoğunlaşacağına bağlıdır. Tabii ki bu yoğunlaşma hücre içindeki organel ve diğer bileşiklerin hareket ve düzenlenmesinden sorumlu olan hücre iskeleti tarafından gerçekleştirilir. mRNA'ların düzensiz dağılmasıyla ilgili bir örneği Drosophila melanogaster'lerin gelişiminde de görebiliriz. Bu durumda yine hücre iskeleti sayesinde mRNA'lar sitoplazmanın farklı kısımlarında yoğunlaşır bu sayede de hangi kısmın kafa hangi kısmın abdomen olacağı belirlenir.  

*Konuyla ilgili daha detaylı bilgi edinmek isteyenler için:Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Chapter 16, The Cytoskeleton. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21051/

Genlerin Yapısı Ve Ekspresyonu | 1

• Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere tüm canlılarda ( prokaryotlarda ve ökaryotlarda) genetik bilginin akışı şu şekildedir : DNA - RNA- Protein. DNA kullanılarak RNA'nın sentezlenmesi olayına transkripsiyon denir ve bu olay nükleusta gerçekleşir. Transkripsiyon sonucu oluşan RNA tiplerinden ( Transkripsiyon sonucunda rRNA, tRNA, non-coding RNA, mRNA gibi RNA çeşitleri oluşabilir.)  biri olan mRNA'nın (mesajcı [messenger] RNA) kalıp olarak kullanılmasıyla protein sentezlenmesi olayına ise translasyon denir ve genellikle sitoplazmada ribozomlar tarafından gerçekleştirilir. ( Burada genellikle denilmesinin sebebi mitokondri ve kloroplast organellerinin kendi ribozomlarına sahip olması dolayısıyla bu organellerde de translasyonun gerçekleşmesidir.) 

• Fakat genetik akışın normalde DNA-RNA-Protein şeklinde olması onun her zaman öyle gerçekleşeceği anlamına gelmez. Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere bu konudaki istisnalardan biri retrovirüslerdir. Retrovirüsler genomlarına göre tek zincirli (+) RNA virüsü konuk hücre tiplerine göre ise hayvan virüsü olarak sınıflandırılırlar. Genom olarak tek zincirli RNA'ya sahip olan retrovirüsler hücreyi enfekte ettiklerinde kendilerini replike edebilmek için öncelikle genomlarını çift zincirli DNA'ya çevirirler. ( Yani burada RNA-DNA şeklinde bir genetik akış olur ve akış reverse transcription yani transkripsiyon olayının tersi olarak adlandırılır.) 

• Genomunu replike edebilmek için önce onu DNA'ya çevirmek zorunda olan retrovirüsler RNA'dan DNA sentezleyecek enzim yani reverse transkriptaz normal hayvan hücrelerinde bulunmadığı için onu yanlarında taşımak zorundadırlar. 
• Buna ek olarak, reverse transkriptaz genel olarak 3 farklı domaine sahiptir. Birinci domain retrovirüsün genomu olan tek zincirli RNA'yı baz alarak tek zincirli DNA sentezler. Bu aşamada önemli olan noktalardan bazıları şunlardır ki reverse transkriptaz da normal DNA polimerazlar gibi sadece 5'-3' yönünde sentez yapabilir ve sentezi başlatamadığı için primere ihtiyaç duyar. İkinci domain oluşturulan DNA-RNA hibridindeki RNA zincirini yıkar. Son domain ise oluşturulan tek zincirli DNA'yı baz alarak çift zincirli DNA sentezler.

• Çift zincirli DNA sentezlendikten sonra ise bu fragment enfekte edilen hücrenin genomuna entegre edilir ve provirüs olarak adlandırılır. Örneğin, HIV virüsü bir retrovirüstür ve bağışıklık sistemi hücrelerinden olan CD4 hücrelerini enfekte ettikten sonra ilk olarak yanında taşıdığı reverse transkriptazı kullanarak genomunu çift zincirli DNA'ya çevirir ve onu çekirdeğe göndererek hücre genomuna entegre eder. Bu işlemden sonra CD4 hücreleri her bölündüğünde dolayısıyla DNA'sını replike ettiğinde virüs genomu da onunla birlikte replike olur ve yeni oluşturulan hücrelere aktarılır. 

Sonuç olarak:

Antimikrobiyal Peptit:Bakteriosin

Bakteriosin çeşitli bakteriler tarafından sentezlenen antimikrobiyal özelliğe sahip bir peptittir. Günümüzde antimikrobiyal özelliğe sahip olması ve insan bağırsak mikrobiyotası üzerinde fazlaca bir etkisi olmaması sebebiyle özellikle gıda koruma endüstrisi gibi endüstrilerde gittikçe popülarite kazanmaktadır. Bugünkü yazıda, gram negatif bakteriler tarafından salgınan kolisin adlı bakteriosinin yapısını ve antimikrobiyal mekanizmasını inceleyecek başka bir yazıda ise bakteriosinlerin olası kullanım alanlarını keşfedeceğiz. Umarım faydalı ve keyifli bir yazı olur. Keyifli okumalar :)

Bakteriosin antibiyotiklerden farklı olarak (antibiyotikler sekonder metabolitlerdir) ribozom tarafından sentezlenen, sentezleyen bakteri haricindeki diğer bakteriler üzerinde ölümcül etkilere sahip olan peptittir.  

Yukarıdaki tabloda sol kısımda bazı bakteriosin çeşitleri, sağ kısımda ise bu bakteriosinleri sentezleyen bakteriler gösterilmektedir. Fakat tabloda bakteriosin sentezleyen bakterilerin tamamına yer verilmemiştir. Yapılan son araştırmalarla birlikte bakterilerin %99’unun en az bir çeşit bakteriosin sentezleyebildiği bilinmektedir.

Kolisin:

Kolisin gram negatif bakteriler tarafından salgılanan bakteriosin çeşididir ve etki ettiği bakteri türleri sentezleyen bakteriye evrimsel olarak yakın olan türlerdir. 

Kolisin sentezleyen bakterilerde bulunan plazmidde kolisin senteziyle ilgili 3 adet gen bulunur:

            Toksin geni: Bu gen kolisini sentezlemekten sorumludur.

            İmmün geni: Bu gen tarafından kodlanan protein sayesinde kolisin, sentezleyen bakteriye zarar veremez.

            Liziz geni : Bu gen tarafından kodlanan protein kolisinin hücre dışına salgılanmasından sorumludur. 

Kolisinin 3 adet etki mekanizması vardır:

• Kolisin A, B, E1, Ia, Ib, K ve N hücre duvarında porlar oluşturarak bakterilerin hücre duvarına zarar vermekte ve böylece bakteriler üzerinde ölümcül bir etkiye sahip olmaktadır.
• Kolisin E2 ve E9 nükleaz aktivitesine sahiptir. Başka bir deyişle, kolisin E2 ve E9 hücre içine girdiğinde bakterinin DNA’sını ve RNA’sını yıkarak onu öldürmektedir.
• Kolisin M ise peptidoglikanaz aktivitesine sahiptir. Böylece kolisin M bakterilerin hücre duvarının yapısını oluşturan peptidoglikanı yıkabilmekte ve onlar üzerinde ölümcül bir etkiye sahip olabilmektedir.

Bakteriosinler her ne kadar kimyasal yapı olarak antibiyotiklere benzemese de, dirençli bakteri türlerine etki edememe özellikleri antibiyotiklere benzemekte ve bu özellik sentezleyen bakterileri kötü bir şekilde etkilemektedir. Örneğin, kolisinin normal şartlar altında ölümcül etkiye sahip olduğu bazı bakteriler geliştirdikleri çeşitli yöntemler sayesinde kolisinin bulunduğu ortamlarda bile yaşayabilmektedir. Bunlara ek olarak, bu bakteriler geliştirdikleri yöntemlere göre 3 gruba ayrılmaktadır:

Dirençli bakteriler: Bu bakteri grubu kolisini tanıyan ve onun hücreye bağlanmasını sağlayan reseptöre sahip olmadığından dolayı, kolisinden hiçbir şekilde etkilenmemektedir.

Tolerant bakteriler: Bu bakteri grubu, kolisinin hücreye bağlandıktan sonra hücre içine girişini sağlayan translokatör proteine sahip olmadığından dolayı, kolisinin çoğu etki mekanizmasını etkisiz hale getirmektedir.
İmmun bakteriler: Bu bakteri grubu sahip olduğu immün protein sayesinde, kolisini inaktive etmekte  ve böylece kolisinden hiçbir şekilde etkilenmemektedir.

Transkripsiyon: Başlama

Transkripsiyon DNA'dan RNA sentezlenmesi olayıdır. DNA nükleusta bulunduğundan dolayı transkripsiyon olayı da nükleusta gerçekleşir.

Transkripsiyonda görev yapan ana enzim RNA polimerazdır. RNA polimeraz ribonükleotit trifosfattaki fosfat bağının enerjisini kullanarak ribonükleotitlerin arasındaki bağın yani fosfodiester bağının oluşmasını sağlar. RNA polimeraz sayesinde ribonükleotitlerin polimerleşmesi sağlanır başka bir deyişle RNA oluşturulmuş olur.

Prokaryotlar tek tip RNA polimeraza sahiptir. Ökaryotlar ise 3 tip RNA polimeraza sahiptir. Bu 3 RNA polimerazın görevleri şu şekildedir:

• RNA polimeraz I rRNA'ların sentezlenmesinden sorumludur.
• RNA polimeraz II mRNA ve snRNA'ların sentezlenmesinden sorumludur.
• RNA polimeraz III 5S rRNA ve tRNA'ların sentezlenmesinden sorumludur.

RNA polimeraz DNA'ya promotor denilen bir bölgeden bağlanır. Promotorun diğer DNA bölgelerinden farkı daha fazla adenin ve timin içermesidir. Başka bir deyişle promotor diğer DNA bölgelerine oranla daha az hidrojen bağı içermektedir. Böylece gen transkripte olacağı zaman DNA sarmalı kolayca açılabilmektedir.

Bakteri ve ökaryotlar promotorlarında farklı bölgelere sahiptir. Bakterilerin promotorunda pribnow kutusu ökaryotların promotorlarında ise TATA kutusu bulunmaktadır.

Transkripsiyonun başlangıç aşamasında, bakterilerin RNA polimerazı sigma alt birimi sayesinde promotoru tanır ve promotora bağlanır. Sigma alt birimi promotora bağlanış gerçekleştikten sonra RNA polimerazdan ayrılır.

Ökaryotlarda ise durum daha karmaşıktır. Ökaryotlarda RNA polimeraz promotora bağlanmadan önce TFIID,TFIIA,TFIIB ve TFIIH gibi transkripsiyon faktörleri promotoru tanır ve bağlanır. Bu faktörler RNA polimerazın promotoru tanımasına ve bağlanmasına yardımcı olur. RNA polimeraz promotora bağlandıktan sonra TFIIH ATP enerjisi kullanarak RNA polimerazı fosforlar ve onun senteze başlamasını tetikler.

Programlı Hücre Ölümü: Apoptoz

Programlı hücre ölümü, diğer hücrelerden gelen ölüm sinyaliyle ya da çoğunlukla yaşam sinyalinin (survival signal) yokluğunda hücrenin kendi kendini yok etme olayıdır. Programlı hücre ölümü insan dahil çoğu hayvanın gelişiminin birçok evresinde görülmektedir. Örneğin, insanlarda nöronların büyük bir kısmı kullanılmamaya bağlı olarak kendi kendini yok etmekte yani programlı hücre ölümü yolunu kullanmaktadır.

Programlı hücre ölümü doku zedelenmesine bağlı olarak oluşan nekrozdan oldukça farklıdır. Programlı hücre ölümünde apoptoz denilen bir yolak kullanılır. Apoptoz süresince öncelikle nüklear zar ve kromozomlar parçalanır ve sitoplazma yoğunlaşır. Daha sonra hücre zarla kaplı küçük keseciklar oluşturacak şekilde parçalara ayrılır. Son olarak bu kesecikler  fagositik hücreler tarafından endositozla alınır ve fagositik hücrelerin lizozomları yardımıyla sindirilir.(Bu olay yukarıdaki resimde özetlenmektedir) Böylece hücrenin içerdiği hiçbir madde direkt olarak dışarı salınmaz ve komşu hücrelerin zarar görmesi engellenir. Nekroz olayı ise dokuların yaralanması sonucu oluşur. Nekroz süresince hücreler içeriklerini direkt olarak hücreler arası sıvıya bıraktığından komşu hücreler oldukça hasar görür.

Apoptoz olayının moleküler yolağının keşfedilmesini sağlayan araştırmaların büyük bir kısmı C.elegans'lar üzerinde yapılmıştır. C.elegans'lar biyoloji dalında yapılan deneylerde çokça kullanılan model organizmalardır. Olgun C.elegans'ların hepsi , mutant olanlar hariç, ilk başta 1090 hücre içermekte sonra da bu hücrelerin 131 tanesini apoptoz yolağını kullanarak kaybetmektedir. C.elegans'ların bu özelliği bilim insanlarına apoptoz olayını incelerken oldukça faydalı olmuştur.Bilim insanları çeşitli genlerde mutasyonlar oluşturarak hücrelerin sayısında olan değişimleri takip etmiş ve bunun sonucunda da apoptozun moleküler mekanizmasını keşfetmiştir.

Apoptoz olayı genellikle hücrenin yaşaması için gerekli olan yaşam sinyalinin eksikliğinde başlar. Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere, sinyal reseptöre bağlanmadığında PI-3-kinaz adlı akt proteinini fosforlayarak onu aktive eden protein inaktive olur. Bunun sonucunda Akt adlı bad proteinini fosforlayarak onu inaktive eden protein aktive olamamış olur. Bad proteini aktif durumda olduğundan mitokondrinin dış zarında  bulunan Bcl-2 ve Bax proteinlerinin aktivitesini değiştirir. Bu aktivite değişimi sonucunda mitokondrinin dış ve iç zarının arasında bulunan sitokrom-c proteini sitoplazmaya doğru hareket eder. Sitokrom- C proteini sitoplazmada inaktive durumda bulunan kaspazların aktive olmasını sağlar. Kaspaz proteinleri, proteinleri C-terminalinden yıkan proteazlardır ve özellikle nüklear lamin ve hücre içi iskeleti proteinlerini hedef alırlar. Kaspaz proteinleri nüklear lamin ve hücre içi iskeletini oluşturan proteinleri yıktıkça hücre yavaş yavaş parçalanmaya başlar. 

Prokaryotlar Ve Ökaryotlar

• Prokaryot denilen canlı grubu bakteri ve arkeleri kapsamaktadır. Ökaryot denilen canlı grubu ise bakteri ve arkeler dışında kalan maya,bitki,hayvan gibi canlı gruplarını kapsamaktadır.

• Prokaryot ve ökaryotlar arasındaki en büyük fark prokaryotların hücre içi zar sistemine sahip olmamasıdır. Başka bir deyişle prokaryotlar zarlı organellere sahip değilken ökaryotlar çekirdek, lizozom, endoplazmik retikulum gibi organellere sahiptir.
• Prokaryotlarda hücre genomunun etrafını saran herhangi bir zar yoktur. DNA sitoplazmada bir yerde yoğunlaşmaktadır ve bu kısım nükleoid olarak adlandırılmaktadır. Ökaryotlarda ise hücre genomu çekirdekte bulunmaktadır yani 2 adet zarla çevrilmiş durumdadır. Bu farklılık transkripsiyon ve translasyon esnasında çeşitli farklılıklara sebep olmaktadır. Örneğin, arada bir zar engeli olmadığından dolayı prokaryotlarda transkripsiyon gerçekleşirken aynı anda translasyon da gerçekleşmektedir.  Ökaryotlarda ise arada nüklear zar bulunduğundan dolayı transkripsiyon bittikten sonra mRNA sitoplazmaya taşınır ve translasyon gerçekleşir.

• Bakteri ve ökaryot genomunun yapısı da birbirinden oldukça farklıdır. Bakterilerin DNA'sı halkasal yapıda ve tek bir replikasyon orijini içerirken ökaryotların DNA'sı linear şekilde ve birden fazla replikasyon orijini içermektedir.

• Bakteri DNA'sı nükleoidde genellikle proteinle sarılmamış bir şekilde bulunur. Ökaryot DNA'sı ise büyüklük bakımından oldukça büyük olduğundan çekirdeğe sığabilmek için histon adlı proteinlerin oluşturduğu nükleozomlarla sarılmış ve paketlenmiş bir şekilde bulunur.

• Hücre duvarı bulundurup bulundurmama ve hücre duvarının içeriği de bir diğer farklılık sebebidir. Bakterilerin bazı istisnalar hariç hepsi hücre duvarı bulundurmaktadır ve hücre duvarları peptidoglikan yapıdadır. Ökaryotlarda hayvan hücreleri hücre duvarı bulundurmazken bitki hücreleri selüloz yapıda hücre duvarına sahiptir.

• Ökaryotlarda sitoplazmada mikrotübül, mikrofilament ve intermediate filamentler tarafından oluşturulan bir hücre içi  iskeleti vardır. Hücre içi iskeleti özellikle hücre duvarı bulundurmayan hayvan hücrelerine mekanik destek, hücreye hareket kabiliyeti ve hücre içi organel ve moleküllere hareket kabiliyeti verir. Prokaryotlarda ise hücre içi iskelet bulunmaz.

Agaroz Jel Elektroforezi

Agaroz jel elektroforezi biyoloji dalında özellikle DNA moleküllerini büyüklük ve konformasyonlarına bağlı olarak ayırmada yaygın kullanılan bir tekniktir.

1. Agaroz jel elektroforezinin yapım aşamasında ilk olarak agaroz jel hazırlanır. Jel, agaroz ve TAE tamponunun karışımından elde edilir. Agaroz maddesi su yosunu türleri olan Gelidium ve Gracilaria canlılarından elde edilir. TAE tamponunun bu karışımda kullanılmasının nedeni ise elektriği iletebilmesidir. 
2. Agaroz ve TAE tamponu jel oluştururken agaroz molekülleri arasında kovalent olmayan bağlar oluşur. Bunun sonucunda agaroz molekülleri konsantrasyonlarına bağlı olarak çeşitli büyüklüklerde porlar oluşturmuş olur.

   

    3.Jel oluştuktan sonra tanka(yukarıdaki resimde yeşil renkli olan) yüklenir.

    

4. DNA molekülleri jel üzerindeki kuyucukları yüklenir. Yüklenmeden önce, yükleme solusyonuyla karıştırılır. Yükleme solusyonu DNA moleküllerinin kuyucuklara rahatça çökebilmesi için gliserol ve elektroforez sırasında DNA'ların görüntülenebilmesi için bromofenol mavisi içerir.

5.DNA molekülleri yüklendikten sonra tankta elektrik alanı oluşabilmesi için tank güç ünitesine bağlanır. Elektrik alanı sayesinde jel üzerinde positif yüke sahip anod ve negatif yüke sahip katod kutupları oluşur.

6.DNA yapısındaki fosfat grubundan ötürü negatif yüklüdür. Bu yüzden elektrik alanı oluşur oluşmaz anod kutbuna doğru hareket etmeye başlar.

7.Tüm DNA molekülleri gittikleri yön bakımından eşittir başka bir deyişle hepsi anod kutbuna doğru giderler. Fakat DNA'ların gidiş hızı özellikle boyutlarına- aynı boyutta olan DNA'larda da konformasyonlarına- göre değişir.

• Yukarıda da bahsedildiği gibi agaroz jel oluşumu sırasında agaroz molekülleri arasında oluşan kovalent olmayan bağlar sonucu porlar oluşur. Bu porlar da küçük olan DNA moleküllerinin daha hızlı, büyük olan DNA moleküllerinin ise daha yavaş hareket etmesine sebep olur.
• Örneğin,  yukarıdaki resimde daha aşağıda olan yani aynı zaman içerisinde daha çok hareket eden DNA molekülleri diğerlerine oranla daha az nükleotit içerirler yani  boyut olarak daha küçüktürler.

• Geçen yıllar içerisinde boyutları bilinen DNA parçaları elde edildiğinden dolayı, agaroz jel elektroforezi hem boyutu bilinmeyen DNA molekülüne hem de boyutu bilinen DNA molekülüne( DNA Ladder) yapıldığı zaman, karşılaştırma yapılarak boyutu bilinmeyen DNA'nın boyutu öğrenebilir. Sonuç olarak, agaroz jel elektroforezi sadece DNA moleküllerini boyutlarına göre ayırmakla kalmaz, onlarla ilgili bilgi edinmemize de yardımcı olur.

Agaroz Jel Elektroforezinin Sonucunun Yorumlanması:

• A şıkkında 1,2 ve 3. kuyucuklarda tek bir bant görülmektedir. Bunun sonucunda söylenebilir ki bu kuyucuklara yüklenen DNA örneklerinde tek bir tip DNA bulunmaktadır. Ayrıca 3 kuyucukta bulunan bant aynı konumda yer aldığı için bu 3 DNA molekülünün boyut olarak birbirlerinin aynısı olduğu söylenebilir.
• B şıkkındaki 2. ve 3. kuyucuklara bakıldığında, 2.kuyucukta 2 ve 3. kuyucukta 3 adet bant olduğu görülmektedir. Bunun sonuncunda bu kuyucuklara yüklenen DNA örneklerinin saf olmadığı ve birden farklı DNA molekülü içerdiği söylenebilir. Ayrıca en sol kısımda bulunan boyutu bilinen DNA örneğiyle karşılaştırıldığına,1. kuyucuğu yüklenen DNA örneğinin boyutunun 23.130 baz çifti olduğu söylenebilir.

DNA Replikasyonunda Görev Alan Enzimler

DNA Polimeraz: 
DNA replikasyonunda görev alan temel enzim DNA polimerazdır. DNA polimeraz nükleotitlerin arasındaki fosfodiester bağının oluşmasını yani nükleotitlerin polimerleşmesini sağlar. DNA polimeraz enerjisini nükleotit trifosfattaki fosfat atomları arasında bulunan bağdan elde eder.

• Yapılan son araştırmalarla birlikte, ökaryot hücrelerde en az 15 tip DNA polimeraz olduğu kanıtlanmıştır. Aşağıdaki resim bu polimerazların görevlerini özetlemektedir.

• Bakteriler ise ökaryotlara kıyasla az sayıda, 3 tip DNA polimeraza sahiptir. Bu polimerazların görevleri aşağıdaki resimde özetlenmiştir.

Helikaz:

DNA çift sarmallı bir yapıya sahiptir. DNA replikasyonu sırasında her bir zincirin başka bir zincire şablon oluşturması gerektiğin dolayı, 2 zincirin bazları arasındaki hidrojen bağlarının kırılması gerekmektedir. Helikaz enzimi ATP enerjisini kullanarak bu hidrojen bağlarını kırar ve DNA'nın 2 zincirinin ayrılıp DNA replikasyonunun başlamasını sağlar.

Tek Zincire Bağlanan Protein:

Tek zincire bağlanan protein, DNA'nın 2 zincirine ayrı ayrı bağlanır. Bu proteinin görevi, helikaz DNA sarmalındaki hidrojen bağlarını yıkıp DNA zincirlerini ayırdıktan sonra, 2 adet zincirin bir araya gelmesini engellemektir.

Primaz:

DNA polimeraz sentez yapabilmek için 3'OH ucuna ihtiyaç duyduğundan, DNA replikasyonunu başlatamaz. DNA replikasyonunun başlaması için primaz enzimi ribonükleotitlerin polimerleşmesini sağlar ve özel bir RNA olan primerin sentezlenmesini sağlar. Primer DNA polimeraz için gerekli OH ucunu sağladığından, DNA polimeraz sentezini gerçekleştirebilir.

DNA Ligaz:

DNA replikasyonu sırasında, DNA polimeraz sadece 5'ucundan 3'ucuna sentez yapabildiği için( bu konuyla ilgili detayları 

https://aboutmolecularbiology.blogspot.com.tr/2017/06/dna-replikasyonu-bolum-2.html 'dan öğrenebilirsiniz) 2 zincirden bir tanesi kesikli olarak sentezlenir ve ortaya Okazaki fragmentleri ortaya çıkar. DNA replikasyonu sona erdikten sonra, DNA ligaz ATP enzimi kullanarak bu fragmentleri bir araya getirir.

DNA Topoizomeraz:

DNA sarmalı helikaz enzimi tarafından açılırken ( Bu olayı bir fermuarın açılmasına benzetebilirsiniz) DNA'nın açılmamış kısımlarında yani alt kısımlarında bir miktar gerilim oluşur. DNA topoizomeraz enzimi DNA'nın tek zinciri üzerinde düzenli kırıklar oluşturarak bu gerilimi azaltır ve DNA'nın bu gerilimden dolayı yapısının bozulmasını önler.