Plazmid

Herhangi bir klonlama deneyine başlarken yapılacak ilk şey neredeyse her zaman plazmid izolasyonudur. Çünkü plazmidler küçük yapıları, bakteriden tutun da insan hücrelerine kadar çok farklı çeşitlilikteki konak hücrelere gönderilebilmesi, üzerinde çok çalışıldığı için modifikasyonlarının kolay olması gibi sebeplerden ötürü moleküler klonlama deneylerinde hep vektör olarak kullanılmaktadır. Ve onları deneylerde kullanabilmek örneğin içine bir gen koyabilmek için öncelikle onları izole etmemiz yani diğer protein ve nükleik asitlerden ayırmamız gerekmektedir.

Plazmid ekstrakromozomal DNA olarak adlandırılan özellikle bakteri ve bazı mayalarda bulunan genomik DNA haricinde hücrede bulunan halkasal DNA'dır. Bu halkasal DNA replikasyon orijini [origin of replication, ori] sayesinde genomik DNA'dan bağımsız olarak replike olur ve yeni oluşan hücrelere dağılımı tamamen rastlantısaldır. Yani yeni oluşan bir hücre bir plazmidin birden fazla kopyasını içerirken diğeri hiç içermeyebilir.

Plazmid normalde yani doğada hücre için elzem olmayan ama gerektiğinde ona avantaj kazandıran genleri taşır. Örneğin, antibiyotik direnç geni, anormal metabolitleri parçalamaya yarayan enzimleri kodlayan genler, restriksiyon enzimlerini kodlayan genler vb. Ama yukarıda da bahsedildiği gibi laboratuvarda vektör olarak kullanılmak üzere izole edilen plazmidler genellikle yapay olarak klonlama için üretilen plazmidlerdir ve onlar amacına göre değişmekle birlikte genelde şunları içerir;

• Ori; plazmidin konak hücrede genomik DNA'dan bağımsız olarak replike olmasını sağlayan replikasyon orijini

• Promotor; eğer plazmid ekspresyon plazmidi ise yani plazmidin içerisine eklenecek olan gen konak hücrede transkripte edilecekse konak hücreye uygun bir promotor plazmidin içerisinde bulunur.

• MCS (Multiple Cloning Site); MCS içerisinde çeşitli restriksiyon enzimleri tarafından tanınacak sekanslar bulunur. Böylece uygun restriksiyon enzimleri hem plazmide hem de PCR ile amplifiye edilmiş gene uygulandığında gen plazmidin içerisine eklenebilir. Ayrıca bazı yapay plazmidlerde MCS'te suicide yani intihar geni bulunur. Bu gen sayesinde restriksiyon enzimleriyle kesildikten sonra gen içeriye alınmadan plazmidin geri kapanması durumunda bu plazmidi içeren bakteriler yaşamayacak böylece de yaşayan bakterilerin kesin olarak geni içerdikleri bilinebilecek. 

• Antibiyotik direnç geni; Plazmidin içerisinde bulunan antibiyotik direnç geni bakterilerin transformasyon sonrasında plazmidi alıp almadığını anlamak için kullanılır. Daha detaylı açıklamak gerekirse; transformasyon sonrasında bakteriler antibiyotik içeren agara ekilir. Böylece plazmidi almayan bakteriler antibiyotik yüzünden agarda yetişemez. Plazmidi alanlar ise plazmidde bulunan antibiyotik direnç geni sayesinde agarda yetişebilir, [ Tabii ki transformasyondan sonra agara ekmeden önce bakteriler antibiyotik içermeyen agarda bir süre yetiştirilir. Böylece plazmidi alan bakteriler antibiyotiğe direnç için gerekli proteinleri sentezleyebilir. ] böylece agarda yetişen bakteri kolonileri plazmid içerdikleri bilindikleri için ilerideki deneylerde kullanılabilirler.

Ek olarak, rekombinant DNA teknolojisiyle yani plazmidin içerisine geni koyarak protein üretimi yapılacaksa ve bu proteine karşı izolasyonda kullanılacak bir antikor yoksa genin ardından his-tag, GFP-tag ya da GST-tag içeren plazmidler rekombinant DNA teknolojisinde kullanılabilir. Böylece transformasyondan sonra bu tagler sayesinde üretilen protein izole edilebilir ya da hücre içerisinde takip edilebilir. Örneğin, eğer plazmid MCS'ten yani genin konulacağı bölgeden sonra GFP (Green fluorescent protein, yeşil floresan proteini) proteinini kodlayan geni içeriyorsa, gen plazmidin içerisine konulduktan ve konak hücrede üretilmeye başladıktan sonra GFP proteinine bağlı bir şekilde üretilir. Ve GFP proteini floresan mikroskobu altından yeşil olarak görüldüğünden diğer protein de mikroskop altında gözlemlenebilir.

Ayrıca, plazmidler sadece bir proteini üretmek için kullanılmaz. Bazen de bir hücrede spesifik bir genin ekspresyonunu engellemek için kullanılabilir. Örneğin, bir genin ekspresyonunu engelleyen kodlama yapmayan RNA'yı yani non-coding RNA'yi kodlayan gen plazmidin içerisine konulursa, konak hücrede non-coding RNA üretilir ve bu da spesifik bir genin ekspresyonunu engeller.

Son olarak deneyde kullanmak üzere vektör seçmek veya sadece incelemek isterseniz; https://www.addgene.org/search/advanced/?q= bunun için oldukça iyi bir kaynak. Sevgiyle ve bilimle kalın :)