- Agaroz jel elektroforezinin yapım aşamasında ilk olarak agaroz jel hazırlanır. Jel, agaroz ve TAE tamponunun karışımından elde edilir. Agaroz maddesi su yosunu türleri olan Gelidium ve Gracilaria canlılarından elde edilir. TAE tamponunun bu karışımda kullanılmasının nedeni ise elektriği iletebilmesidir.
- Agaroz ve TAE tamponu jel oluştururken agaroz molekülleri arasında kovalent olmayan bağlar oluşur. Bunun sonucunda agaroz molekülleri konsantrasyonlarına bağlı olarak çeşitli büyüklüklerde porlar oluşturmuş olur.
3.Jel oluştuktan sonra tanka(yukarıdaki resimde yeşil renkli olan) yüklenir.
4. DNA molekülleri jel üzerindeki kuyucukları yüklenir. Yüklenmeden önce, yükleme solusyonuyla karıştırılır. Yükleme solusyonu DNA moleküllerinin kuyucuklara rahatça çökebilmesi için gliserol ve elektroforez sırasında DNA'ların görüntülenebilmesi için bromofenol mavisi içerir.
5.DNA molekülleri yüklendikten sonra tankta elektrik alanı oluşabilmesi için tank güç ünitesine bağlanır. Elektrik alanı sayesinde jel üzerinde positif yüke sahip anod ve negatif yüke sahip katod kutupları oluşur.
6.DNA yapısındaki fosfat grubundan ötürü negatif yüklüdür. Bu yüzden elektrik alanı oluşur oluşmaz anod kutbuna doğru hareket etmeye başlar.
7.Tüm DNA molekülleri gittikleri yön bakımından eşittir başka bir deyişle hepsi anod kutbuna doğru giderler. Fakat DNA'ların gidiş hızı özellikle boyutlarına- aynı boyutta olan DNA'larda da konformasyonlarına- göre değişir.
- Yukarıda da bahsedildiği gibi agaroz jel oluşumu sırasında agaroz molekülleri arasında oluşan kovalent olmayan bağlar sonucu porlar oluşur. Bu porlar da küçük olan DNA moleküllerinin daha hızlı, büyük olan DNA moleküllerinin ise daha yavaş hareket etmesine sebep olur.
- Örneğin, yukarıdaki resimde daha aşağıda olan yani aynı zaman içerisinde daha çok hareket eden DNA molekülleri diğerlerine oranla daha az nükleotit içerirler yani boyut olarak daha küçüktürler.
- Geçen yıllar içerisinde boyutları bilinen DNA parçaları elde edildiğinden dolayı, agaroz jel elektroforezi hem boyutu bilinmeyen DNA molekülüne hem de boyutu bilinen DNA molekülüne( DNA Ladder) yapıldığı zaman, karşılaştırma yapılarak boyutu bilinmeyen DNA'nın boyutu öğrenebilir. Sonuç olarak, agaroz jel elektroforezi sadece DNA moleküllerini boyutlarına göre ayırmakla kalmaz, onlarla ilgili bilgi edinmemize de yardımcı olur.
Agaroz Jel Elektroforezinin Sonucunun Yorumlanması:
- A şıkkında 1,2 ve 3. kuyucuklarda tek bir bant görülmektedir. Bunun sonucunda söylenebilir ki bu kuyucuklara yüklenen DNA örneklerinde tek bir tip DNA bulunmaktadır. Ayrıca 3 kuyucukta bulunan bant aynı konumda yer aldığı için bu 3 DNA molekülünün boyut olarak birbirlerinin aynısı olduğu söylenebilir.
- B şıkkındaki 2. ve 3. kuyucuklara bakıldığında, 2.kuyucukta 2 ve 3. kuyucukta 3 adet bant olduğu görülmektedir. Bunun sonuncunda bu kuyucuklara yüklenen DNA örneklerinin saf olmadığı ve birden farklı DNA molekülü içerdiği söylenebilir. Ayrıca en sol kısımda bulunan boyutu bilinen DNA örneğiyle karşılaştırıldığına,1. kuyucuğu yüklenen DNA örneğinin boyutunun 23.130 baz çifti olduğu söylenebilir.
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder