Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)| 1

• Polimeraz zincir reaksiyonu 1980'li yıllarda daha sonra bu buluşundan dolayı Nobel ödülü alan Kary Mullis tarafından icat edilmiştir. (Yukarıdaki resim Kary Mullis'in hayat hikayesini anlattığı kitabının kapağıdır ve bu noktada bence eklemek gerekir ki Kary Mullis hayat hikayesinin ilginçliğiyle diğer bilim insanlarından keskin bir şekilde ayrılmaktadır.) 

• PCR, DNA polimeraz enzimi sayesinde çok düşük konsantrasyonlu DNA örneklerinden bile yeni DNA zincirleri sentezleyen bir başka deyişle mevcut olan DNA fragmentini çoğaltan bir yöntemdir. Ve DNA polimeraz sadece 3'-OH ucuna yeni nükleotit ekleyebildiğinden ve bundan dolayı bir zincirin sentezini başlatabilmek için primere ihtiyaç duyduğundan PCR işlemi de primere ihtiyaç duyar.Bu sayede de (primerler sekansa spesifik olduğundan dolayı) PCR işlemiyle sadece istenilen DNA fragmentinin bilyonlarca kopyası saatler içinde elde edilebilir.

• PCR methodu kullanılarak sekanslama ve klonlama için gereken sayıda fragment elde edilebilir, bir genin yahut bir allelin genomda bulunup bulunmadığı kanıtlanabilir, babalık testi veya kriminal olaylarda şüphelilerin sayısı azaltılabilir ve laboratuvar ortamında üretilemeyen mikroorganizmalarla ilgili bilgilere ulaşılabilir.

• PCR reaksiyonu için gerekenler DNA örneği, primer, DNA polimeraz, dNTP, tampon solüsyon ve distile sudur. 

• Mevcut DNA örneğinden sadece istenilen bölgenin çoğaltılması olayında en önemli şeylerden biri ileri ve geri yönlü (forward and reverse primers) primerlerin doğru dizayn edilmiş olması ve doğru konsantrasyonda olmasıdır. Örneğin, primerlerin konsantrasyonu 0.1 - 0.5 µM ( genellikle tercihen 0.2 µM ) olmalıdır. Eğer primer konsantrasyonu gerekenden fazla olursa istenmeyen bölgelerin de amplifikasyonu gerçekleşebilir. Bununla birlikte eğer primer konsantrasyonu gerekenden az olursa istenilen fragmentten yeterli miktarda elde edilemeyebilir. Tabii ki bu noktada primerlerin özellikleri de ( Tm değeri, spesifiklik vs.) çok önemlidir. 

• PCR reaksiyonunda kullanılan primerler hücrede DNA replikasyonu sırasında kullanılan primerlerden farklıdır. DNA replikasyonu sırasında primeraz tarafından üretilen primerler tek zincirli RNA iken PCR sırasında kullanılan primerler tek zincirli DNAdır. 

• İleriki kısımlarda görüleceği üzere PCR çok yüksek ve dramatik olarak değişen sıcaklıklarda gerçekleşmektedir. Bu yüzden de eğer normal bir DNA polimeraz (örneğin insan hücrelerinde bulunan DNA polimeraz) kullanılırsa daha reaksiyon başlamadan enzim sıcaklıktan denatüre olacağı için amplifikasyon gerçekleşmez. Bu sebepten dolayı PCR reaksiyonu için genellikle Taq DNA polimeraz, (Thermus aquaticus' tan elde edilir) ve Pfu DNA polimeraz (Pyrococcus furiosus' tan elde edilir) kullanılır. Taq DNA polimeraz Pfu DNA polimeraza göre daha ucuz olması sebebiyle araştırmalarda daha çok kullanılmaktadır ancak Pfu DNA polimerazın hata oranı Taq DNA polimeraza oranla daha düşüktür. 

• DNA örneği de PCR reaksiyonu için gerekli olan şeylerden biridir. Bunun sebebi de DNA polimerazın yeni oluşturulan zincire nükleotit eklemek için şablona ihtiyaç duymasıdır. Buna ek olarak, GC oranı yüksek olan DNA örneklerinin (GC% > 60%) amplifikasyonu diğer DNA örneklerine göre daha zordur ve bu durumun en olası sebebi bu DNA örneklerinde oluşan kararlı ikincil yapılardır. Eğer araştırma esnasında böyle bir DNA örneğinin amplifikasyonu gerekiyorsa, bilim insanları genellikle  glycerol, DMSO (5-20%), formamide (5-20%) veya tetramethylammonium chloride (0.01-10 mM) gibi bileşikleri PCR solüsyonuna eklemektedir. 

• PCR solüsyonunu hazırlarken dikkat edilmesi gereken 2 önemli nokta vardır. Öncelikle istenmeyen kısımların amplifikasyonunu önlemek için PCR solüsyonu hazırlanırken DNA polimeraz en son ilave edilmelidir. İkinci olarak ise reaksiyonun başlamasını önlemek için tüm hazırlık aşamalarında solüsyon buz üzerinde tutulmalıdır. 

Genlerin Yapısı Ve Ekspresyonu | 1

• Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere tüm canlılarda ( prokaryotlarda ve ökaryotlarda) genetik bilginin akışı şu şekildedir : DNA - RNA- Protein. DNA kullanılarak RNA'nın sentezlenmesi olayına transkripsiyon denir ve bu olay nükleusta gerçekleşir. Transkripsiyon sonucu oluşan RNA tiplerinden ( Transkripsiyon sonucunda rRNA, tRNA, non-coding RNA, mRNA gibi RNA çeşitleri oluşabilir.)  biri olan mRNA'nın (mesajcı [messenger] RNA) kalıp olarak kullanılmasıyla protein sentezlenmesi olayına ise translasyon denir ve genellikle sitoplazmada ribozomlar tarafından gerçekleştirilir. ( Burada genellikle denilmesinin sebebi mitokondri ve kloroplast organellerinin kendi ribozomlarına sahip olması dolayısıyla bu organellerde de translasyonun gerçekleşmesidir.) 

• Fakat genetik akışın normalde DNA-RNA-Protein şeklinde olması onun her zaman öyle gerçekleşeceği anlamına gelmez. Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere bu konudaki istisnalardan biri retrovirüslerdir. Retrovirüsler genomlarına göre tek zincirli (+) RNA virüsü konuk hücre tiplerine göre ise hayvan virüsü olarak sınıflandırılırlar. Genom olarak tek zincirli RNA'ya sahip olan retrovirüsler hücreyi enfekte ettiklerinde kendilerini replike edebilmek için öncelikle genomlarını çift zincirli DNA'ya çevirirler. ( Yani burada RNA-DNA şeklinde bir genetik akış olur ve akış reverse transcription yani transkripsiyon olayının tersi olarak adlandırılır.) 

• Genomunu replike edebilmek için önce onu DNA'ya çevirmek zorunda olan retrovirüsler RNA'dan DNA sentezleyecek enzim yani reverse transkriptaz normal hayvan hücrelerinde bulunmadığı için onu yanlarında taşımak zorundadırlar. 
• Buna ek olarak, reverse transkriptaz genel olarak 3 farklı domaine sahiptir. Birinci domain retrovirüsün genomu olan tek zincirli RNA'yı baz alarak tek zincirli DNA sentezler. Bu aşamada önemli olan noktalardan bazıları şunlardır ki reverse transkriptaz da normal DNA polimerazlar gibi sadece 5'-3' yönünde sentez yapabilir ve sentezi başlatamadığı için primere ihtiyaç duyar. İkinci domain oluşturulan DNA-RNA hibridindeki RNA zincirini yıkar. Son domain ise oluşturulan tek zincirli DNA'yı baz alarak çift zincirli DNA sentezler.

• Çift zincirli DNA sentezlendikten sonra ise bu fragment enfekte edilen hücrenin genomuna entegre edilir ve provirüs olarak adlandırılır. Örneğin, HIV virüsü bir retrovirüstür ve bağışıklık sistemi hücrelerinden olan CD4 hücrelerini enfekte ettikten sonra ilk olarak yanında taşıdığı reverse transkriptazı kullanarak genomunu çift zincirli DNA'ya çevirir ve onu çekirdeğe göndererek hücre genomuna entegre eder. Bu işlemden sonra CD4 hücreleri her bölündüğünde dolayısıyla DNA'sını replike ettiğinde virüs genomu da onunla birlikte replike olur ve yeni oluşturulan hücrelere aktarılır. 

Sonuç olarak: