Genlerin Yapısı Ve Ekspresyonu | 2 (Promotor, 5' Ve 3' UTR, RNA İşlenmesi)

• Yukarıdaki resimde ökaryotik hücrelerin genomunda bulunan genlerin tipik yapısı gösterilmektedir. 
• DNA düzeyinde incelemeye başlarsak, çekirdekte bulunan kromozomlarda konumlanan genler genel olarak 5 temel yapıdan oluşur:

1. Promotor:

• Promotor transkripsiyonun başlaması esnasında RNA polimerazın ve transkripsiyon faktörlerinin bağlandığı kısımdır.
• Tüm ökaryotlar promotorlarında korunmuş bir dizi ve transkripsiyon başlama bölgesinden yaklaşık olarak 25-35 baz uzaklıkta olan TATA kutusunu bulundururlar.
• Promotorlar transkripsiyonu başlatma işinden sorumlu oldukları için transkripsiyonun yönünü ve hangi zincirin transkripte olacağını bir başka deyişle hangi zincirin anlamlı zincir olduğunu belirlerler.
• Resimde de görülebileceği üzere promotorlar transkripte olmadıkları için mRNA'larda bulunmazlar.

    2. 5' UTR ( 5' Untranslated Region ) ve 3' UTR ( 3' Untranslated Region) : 

• 5' UTR ve 3' UTR genin transkripte olan ama translasyona uğramayan bölümleridir. Adlarından da anlaşılabileceği üzere 5' UTR genin 5' ucunda, 3' UTR ise genin 3' ucunda konumlanır. Birçok farklı fonksiyona sahip olan 5' ve 3' UTR'ler temel olarak mRNA'ların nükleustan sitoplazmaya taşınmalarından, mRNA'ların post-transkripsiyonel kontrollerinden ve stabilitelerinden sorumludurlar.
• Ayrıca belirtilmelidir ki geçmişte sanılanın aksine (özellikle 5' UTR'nin) UTR'lerin gen ekspresyonunun kontrolünde önemli bir rolü vardır. Yapılan araştırmalar UTR'lerinde mutasyon bulunan bireylerin çoğunda patolojik bulgulara ulaşmıştır.
• UTR'ler tarafından gerçekleştirilen post-transkripyonel kontrolde UTR'lerin sekansları ve buna bağlı olarak oluşan birincil ve ikincil yapıları önemli rol oynamaktadır. ( Bu noktada belirtilmelidir ki DNA düzeyinde olan gen ekspresyonu kontrolünde sadece birincil yapı önemli rol oynamaktadır.) UTR'lerin birincil ve ikincil yapılarına göre farklı RNA'ya bağlanan proteinler (RNA binding proteins) ve kodlama yapmayan RNAlar ( Non-coding RNA) UTR'lere bağlanmakta bunun sonucunda da UTR'lere bağlı olarak mRNA'lar farklı verimlilikte translasyona uğramakta ve stabiliteleri farklılık göstermektedir.
• 5' UTR genel olarak translasyonel kontrolden sorumluyken 3' UTR mRNA'nın nükleustan sitoplazmaya transfer edilmesi ve stabilitesinin belirlenmesinden sorumludur.

• Son olarak, 5' UTR ile 3' UTR'nin hangisinin daha önemli olduğu konusunda (yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere) 3' UTR'deki mutasyon oranı 5' UTR'ye oranla daha yüksek olduğu için 5' UTR'nin fonksiyonlarının 3' UTR'nin fonksiyonlarına oranla daha önemli olduğu söylenebilir.

• Konuyla ilgili daha detaylı bilgi için: Mignone, F., Gissi, C., Liuni, S., & Pesole, G. (2002). Untranslated regions of mRNAs. Genome Biology, 3(3), reviews0004.1–reviews0004.10.

    3. ORF ( Open Reading Frame ) : 

• ORF gene ait olan intron ve ekzonların konumlandığı kısımdır.
• Ekzonlar mRNA işlenmesinden sonrada mRNA'da bulunmaya devam eden ve proteinin amino asit dizilimini belirleyen bir başka deyişle proteinleri kodlayan kısımdır.
• Ve beklenenin aksine genomun sadece 1.5 - 2% 'lik bir kısmı ekzonlardan oluşur. Yani sanılanın aksine genomun büyük bir kısmını protein kodlayan ekzonlar değil, kodlama yapmayan intronlar, tekrarlayan fragmentler ve gen ekspresyonunu kontrol eden promotorlar vb.'ler oluşturur.
• İntronlar ise mRNA'nın işlenmesi sırasında ayrıştırılan ve dolayısıyla translasyona uğramayan gen bölgeleridir.
• İnsan genomunun %25 'i intronlardan oluşur. ( Fark edilebileceği üzere intronlar ekzonlardan çok daha fazla yer kaplıyor genomda.)
• İntronların protein kodlamaması onların genomda boşu boşuna bulunduklarını göstermemektedir. Bir başka deyişle, intronlar ilk keşfedildiklerinde düşünülenin aksine "junk DNA" değildir. Yapılan son araştırmalar, intronların bir genden birden fazla protein üretilmesini sağlayan "alternative splicing" olayında görev aldığını ve genlerin transkripsiyon oranlarını arttırdığını göstermektedir. ( Örneğin, yapılan bir araştırmada genomuna yapay olarak intron eklenen virüsün proteinlerinin oranın intron içermeyen virüsün proteinlerinin oranına göre daha fazla olduğu kanıtlanmıştır.)
• İntronların görevleriyle ilgili daha detaylı bilgi için: Jo, B.-S., & Choi, S. S. (2015). Introns: The Functional Benefits of Introns in Genomes. Genomics & Informatics, 13(4), 112–118. http://doi.org/10.5808/GI.2015.13.4.112

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)| 1

• Polimeraz zincir reaksiyonu 1980'li yıllarda daha sonra bu buluşundan dolayı Nobel ödülü alan Kary Mullis tarafından icat edilmiştir. (Yukarıdaki resim Kary Mullis'in hayat hikayesini anlattığı kitabının kapağıdır ve bu noktada bence eklemek gerekir ki Kary Mullis hayat hikayesinin ilginçliğiyle diğer bilim insanlarından keskin bir şekilde ayrılmaktadır.) 

• PCR, DNA polimeraz enzimi sayesinde çok düşük konsantrasyonlu DNA örneklerinden bile yeni DNA zincirleri sentezleyen bir başka deyişle mevcut olan DNA fragmentini çoğaltan bir yöntemdir. Ve DNA polimeraz sadece 3'-OH ucuna yeni nükleotit ekleyebildiğinden ve bundan dolayı bir zincirin sentezini başlatabilmek için primere ihtiyaç duyduğundan PCR işlemi de primere ihtiyaç duyar.Bu sayede de (primerler sekansa spesifik olduğundan dolayı) PCR işlemiyle sadece istenilen DNA fragmentinin bilyonlarca kopyası saatler içinde elde edilebilir.

• PCR methodu kullanılarak sekanslama ve klonlama için gereken sayıda fragment elde edilebilir, bir genin yahut bir allelin genomda bulunup bulunmadığı kanıtlanabilir, babalık testi veya kriminal olaylarda şüphelilerin sayısı azaltılabilir ve laboratuvar ortamında üretilemeyen mikroorganizmalarla ilgili bilgilere ulaşılabilir.

• PCR reaksiyonu için gerekenler DNA örneği, primer, DNA polimeraz, dNTP, tampon solüsyon ve distile sudur. 

• Mevcut DNA örneğinden sadece istenilen bölgenin çoğaltılması olayında en önemli şeylerden biri ileri ve geri yönlü (forward and reverse primers) primerlerin doğru dizayn edilmiş olması ve doğru konsantrasyonda olmasıdır. Örneğin, primerlerin konsantrasyonu 0.1 - 0.5 µM ( genellikle tercihen 0.2 µM ) olmalıdır. Eğer primer konsantrasyonu gerekenden fazla olursa istenmeyen bölgelerin de amplifikasyonu gerçekleşebilir. Bununla birlikte eğer primer konsantrasyonu gerekenden az olursa istenilen fragmentten yeterli miktarda elde edilemeyebilir. Tabii ki bu noktada primerlerin özellikleri de ( Tm değeri, spesifiklik vs.) çok önemlidir. 

• PCR reaksiyonunda kullanılan primerler hücrede DNA replikasyonu sırasında kullanılan primerlerden farklıdır. DNA replikasyonu sırasında primeraz tarafından üretilen primerler tek zincirli RNA iken PCR sırasında kullanılan primerler tek zincirli DNAdır. 

• İleriki kısımlarda görüleceği üzere PCR çok yüksek ve dramatik olarak değişen sıcaklıklarda gerçekleşmektedir. Bu yüzden de eğer normal bir DNA polimeraz (örneğin insan hücrelerinde bulunan DNA polimeraz) kullanılırsa daha reaksiyon başlamadan enzim sıcaklıktan denatüre olacağı için amplifikasyon gerçekleşmez. Bu sebepten dolayı PCR reaksiyonu için genellikle Taq DNA polimeraz, (Thermus aquaticus' tan elde edilir) ve Pfu DNA polimeraz (Pyrococcus furiosus' tan elde edilir) kullanılır. Taq DNA polimeraz Pfu DNA polimeraza göre daha ucuz olması sebebiyle araştırmalarda daha çok kullanılmaktadır ancak Pfu DNA polimerazın hata oranı Taq DNA polimeraza oranla daha düşüktür. 

• DNA örneği de PCR reaksiyonu için gerekli olan şeylerden biridir. Bunun sebebi de DNA polimerazın yeni oluşturulan zincire nükleotit eklemek için şablona ihtiyaç duymasıdır. Buna ek olarak, GC oranı yüksek olan DNA örneklerinin (GC% > 60%) amplifikasyonu diğer DNA örneklerine göre daha zordur ve bu durumun en olası sebebi bu DNA örneklerinde oluşan kararlı ikincil yapılardır. Eğer araştırma esnasında böyle bir DNA örneğinin amplifikasyonu gerekiyorsa, bilim insanları genellikle  glycerol, DMSO (5-20%), formamide (5-20%) veya tetramethylammonium chloride (0.01-10 mM) gibi bileşikleri PCR solüsyonuna eklemektedir. 

• PCR solüsyonunu hazırlarken dikkat edilmesi gereken 2 önemli nokta vardır. Öncelikle istenmeyen kısımların amplifikasyonunu önlemek için PCR solüsyonu hazırlanırken DNA polimeraz en son ilave edilmelidir. İkinci olarak ise reaksiyonun başlamasını önlemek için tüm hazırlık aşamalarında solüsyon buz üzerinde tutulmalıdır. 

Hücre İskeleti | Giriş

• Yukarıdaki resimde görülen kırmızı, yeşil ve mavi renklerle işaretlenmiş olan filamentler hücre iskeletini oluşturur. Yani aslında hücre iskeleti sitoplazma boyunca dağılmış olan filamentler bütünüdür.

• Hücre iskeleti sayesinde hücreler belirli şekilleri alabilir hatta bazı özel hücreler hücre iskeletlerini tekrardan yapılandırarak değişen çevre koşullarına göre şekillerini değiştirebilirler. Ayrıca belirtmekte fayda var, hücre iskeleti hücreye şekil vermekle kalmaz, ona fiziksel dayanıklılık da verir.
• Amip ve bazı bağışıklık sistemi hücreleri hücre iskeletini oluşturan filamentlerden aktini kullanarak çevre koşullarına (özellikle bağışıklık sistemi hücreleri diğer hücrelerden salınan kimyasallara) göre hareket ederler.

• Hücre iskeleti hücreyi dış ortama adapte etmekle kalmaz bölünme, büyüme gibi özel durumlarda organelleri ve diğer hücre içi bileşenleri çeşitli yerlere taşıyarak hücre içi yapısını da değiştirir.

• Mitoz ve mayoz esnasında kromozomların ayrılması hücre iskeletini oluşturan filamentlerden mikrotübüller tarafından gerçekleştirilir. Ayrıca unutulmamalıdır ki mitoz ve mayoz sadece çekirdeğin bölünmesi olayıdır. 
• Karbonhidrat, yağ ve proteinlerin oluşan ve akışkan (dolayısıyla da kırılgan) bir yapıya sahip olan plazma membranına mekanik destek vermek hücre iskeletinin görevlerinden bir tanesidir.
• Hücre iskeleti kas ve nöron gibi oldukça özelleşmiş hücrelerin fonksiyonlarını yerine getirmesini sağlar. Örneğin, hücre iskeleti kas hücrelerin kasılmadan nöronlarda ise akson ve dendritlerin oluşumundan sorumludur.

• Sitoplazmada bulunan proteinler ve mRNA'lar her zaman homojenik bir şekilde dağılmaz. Yukarıdaki resimde görülen olay da bu düzensiz dağılımın örneklerinden biridir. Detaylıca anlatmak gerekirse, bazı durumlarda mRNA'ların veya proteinlerin sitoplazmanın bir kısmında yoğunlaşması çeşitli sonuçlara sebep olur. Örneğin, yukarıdaki resimdede görülebileceği üzere bölünmekte olan bir maya hücresinde yeni oluşacak hücrenin hücrenin hangi kısmından çıkacağı ash1 olarak adlandırılan mRNA'nın hücrenin hangi kısmında yoğunlaşacağına bağlıdır. Tabii ki bu yoğunlaşma hücre içindeki organel ve diğer bileşiklerin hareket ve düzenlenmesinden sorumlu olan hücre iskeleti tarafından gerçekleştirilir. mRNA'ların düzensiz dağılmasıyla ilgili bir örneği Drosophila melanogaster'lerin gelişiminde de görebiliriz. Bu durumda yine hücre iskeleti sayesinde mRNA'lar sitoplazmanın farklı kısımlarında yoğunlaşır bu sayede de hangi kısmın kafa hangi kısmın abdomen olacağı belirlenir.  

*Konuyla ilgili daha detaylı bilgi edinmek isteyenler için:Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Chapter 16, The Cytoskeleton. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21051/

Genlerin Yapısı Ve Ekspresyonu | 1

• Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere tüm canlılarda ( prokaryotlarda ve ökaryotlarda) genetik bilginin akışı şu şekildedir : DNA - RNA- Protein. DNA kullanılarak RNA'nın sentezlenmesi olayına transkripsiyon denir ve bu olay nükleusta gerçekleşir. Transkripsiyon sonucu oluşan RNA tiplerinden ( Transkripsiyon sonucunda rRNA, tRNA, non-coding RNA, mRNA gibi RNA çeşitleri oluşabilir.)  biri olan mRNA'nın (mesajcı [messenger] RNA) kalıp olarak kullanılmasıyla protein sentezlenmesi olayına ise translasyon denir ve genellikle sitoplazmada ribozomlar tarafından gerçekleştirilir. ( Burada genellikle denilmesinin sebebi mitokondri ve kloroplast organellerinin kendi ribozomlarına sahip olması dolayısıyla bu organellerde de translasyonun gerçekleşmesidir.) 

• Fakat genetik akışın normalde DNA-RNA-Protein şeklinde olması onun her zaman öyle gerçekleşeceği anlamına gelmez. Yukarıdaki resimde de görülebileceği üzere bu konudaki istisnalardan biri retrovirüslerdir. Retrovirüsler genomlarına göre tek zincirli (+) RNA virüsü konuk hücre tiplerine göre ise hayvan virüsü olarak sınıflandırılırlar. Genom olarak tek zincirli RNA'ya sahip olan retrovirüsler hücreyi enfekte ettiklerinde kendilerini replike edebilmek için öncelikle genomlarını çift zincirli DNA'ya çevirirler. ( Yani burada RNA-DNA şeklinde bir genetik akış olur ve akış reverse transcription yani transkripsiyon olayının tersi olarak adlandırılır.) 

• Genomunu replike edebilmek için önce onu DNA'ya çevirmek zorunda olan retrovirüsler RNA'dan DNA sentezleyecek enzim yani reverse transkriptaz normal hayvan hücrelerinde bulunmadığı için onu yanlarında taşımak zorundadırlar. 
• Buna ek olarak, reverse transkriptaz genel olarak 3 farklı domaine sahiptir. Birinci domain retrovirüsün genomu olan tek zincirli RNA'yı baz alarak tek zincirli DNA sentezler. Bu aşamada önemli olan noktalardan bazıları şunlardır ki reverse transkriptaz da normal DNA polimerazlar gibi sadece 5'-3' yönünde sentez yapabilir ve sentezi başlatamadığı için primere ihtiyaç duyar. İkinci domain oluşturulan DNA-RNA hibridindeki RNA zincirini yıkar. Son domain ise oluşturulan tek zincirli DNA'yı baz alarak çift zincirli DNA sentezler.

• Çift zincirli DNA sentezlendikten sonra ise bu fragment enfekte edilen hücrenin genomuna entegre edilir ve provirüs olarak adlandırılır. Örneğin, HIV virüsü bir retrovirüstür ve bağışıklık sistemi hücrelerinden olan CD4 hücrelerini enfekte ettikten sonra ilk olarak yanında taşıdığı reverse transkriptazı kullanarak genomunu çift zincirli DNA'ya çevirir ve onu çekirdeğe göndererek hücre genomuna entegre eder. Bu işlemden sonra CD4 hücreleri her bölündüğünde dolayısıyla DNA'sını replike ettiğinde virüs genomu da onunla birlikte replike olur ve yeni oluşturulan hücrelere aktarılır. 

Sonuç olarak: